Your browser does not support JavaScript!

Αρχική    Δομικές μελέτες της πρωτεΐνης Ηrcqb από το τύπου ΙΙΙ εκκριτικό σύστημα tης Pseudomonas syringae  

Αποτελέσματα - Λεπτομέρειες

Προσθήκη στο καλάθι
[Προσθήκη στο καλάθι]
Κωδικός Πόρου uch.biology.phd//2004fadouloglou
Τίτλος Δομικές μελέτες της πρωτεΐνης Ηrcqb από το τύπου ΙΙΙ εκκριτικό σύστημα tης Pseudomonas syringae
Άλλος τίτλος Structural studies of the HRCqb protein from the type III secretion system of Pseudomonas syringae
Συγγραφέας Φαδούλογλου, Βασιλική Ε
Σύμβουλος διατριβής Κοκκινίδης, Μ.
Περίληψη Αντικείμενο της παρούσας διατριβής είναι η δομική μελέτη της πρωτεΐνης HrcQB από το φυτοπαθογόνο βακτήριο Pseudomonas syringae pv. phaseolicola. Έμφαση δόθηκε στο καρβοξυτελικό άκρο της πρωτεΐνης (79 κατάλοιπα) στο οποίο εντοπίζεται υψηλή αμινοξική συντήρηση με ομόλογες από άλλα φύτο- και ζωοπαθογόνα. Η πρωτεΐνη αποτελεί συντηρημένο μέλος της τύπου ΙΙΙ εκκριτικής μηχανής των Gram-αρνητικών βακτηρίων ενώ ομόλογες πρωτεΐνες συμμετέχουν επίσης στο μηχανισμό βιογένεσης του μαστιγίου. Για τον προσδιορισμό της δομής χρησιμοποιήθηκε η μέθοδος της κρυσταλλογραφίας ακτίνων Χ. Αρχικά, η πλήρους μήκους HrcQB απομονώθηκε από κύτταρα Escherichia coli που την υπερέκφραζαν. Γρήγορα διαπιστώθηκε ότι είναι ένα μόριο ιδιαίτερα ευαίσθητο σε πρωτεόλυση. Προσπάθειες για τη βελτιστοποίηση της πορείας απομόνωσης κατέληξαν σε ένα σχήμα καθαρισμού που απέδιδε σχετικά σταθερό και καθαρό προϊόν. Παρόλα αυτά, όλες οι προσπάθειες κρυστάλλωσης της πρωτεΐνης απέβησαν άκαρπες. Στη συνέχεια, η προσοχή μας εστιάστηκε στα 79 κατάλοιπα του καρβοξυτελικού άκρου (HrcQB-C) στα οποία συγκεντρώνονται υψηλές ομοιότητες με τις άλλες ομόλογες πρωτεΐνες. Η HrcQB-C που είναι ιδιαίτερα σταθερό μόριο, κρυστάλλωσε με τη μέθοδο διάχυσης ατμών από MPD και Mg(AcO)2. Οι κρύσταλλοι είχαν σχήμα λεπτής πλάκας και οι περισσότεροι από αυτούς παρουσίαζαν ανωμαλίες στο κρυσταλλικό τους πλέγμα όπως έγινε αντιληπτό από τα προβληματικά διαγράμματα περίθλασης που παρήγαγαν. Προσπάθειες να βελτιωθεί η ποιότητα αυτών των κρυστάλλων ή να βρεθούν άλλες συνθήκες κρυστάλλωσης ήταν ανεπιτυχείς. Οι κακής ποιότητας κρύσταλλοι δυσχέρηναν την επίλυση του προβλήματος των φάσεων. Η εύρεση χρήσιμου παραγώγου βαρέως μετάλλου στάθηκε αδύνατη ενώ η τεχνική Multiple Anomalous Diffraction (MAD) κατέληξε σε επιτυχία μόνο μετά τη μετάλλαξη μιας λευκίνης στο εσωτερικό της δομής σε μεθειονίνη και την εν συνεχεία υποκατάσταση της μεθειονίνης από σεληνομεθειονίνη. Το υποκατεστημένο μετάλλαγμα απομονώθηκε και κρυστάλλωσε χωρίς σημαντικές αποκλίσεις από το φυσικό μόριο. Η δομή προσδιορίστηκε από ένα σύνολο δεδομένων που συλλέχτηκε σε τρία μήκη κύματος, στην περιοχή του μεγίστου απορρόφησης του σεληνίου και βελτιστοποιήθηκε μέχρι τη διακριτικότητα των 2.3 ?. Η κρυσταλλική δομή της HrcQB-C είναι ένα επίμηκες, ελαφρά κυρτωμένο ομοτετραμερές με κύριο στοιχείο δευτεροταγούς δομής την β-πτυχωτή επιφάνεια. Τα τέσσερα μονομερή συναθροίζονται σε δύο διμερή που πακετάρονται μαζί και σχηματίζουν ένα διμερές διμερών. Το τετραμερές σταθεροποιείται με αρκετούς δεσμούς υδρογόνου. Επιπλέον, το σχετικά μεγάλο εμβαδό της μεσεπιφάνειας μεταξύ των διμερών (~1200 ?2) και η συμφωνία της υδροδυναμικής ακτίνας της HrcQB-C σε διάλυμα -όπως εκτιμήθηκε από χρωματογραφία μοριακής διήθησης- με την υδροδυναμική ακτίνα που υπολογίζεται για το τετραμερές, φαίνεται να υποστηρίζουν την άποψη ότι το τετραμερές είναι το βιολογικά ενεργό μόριο. Αξίζει επίσης να σημειωθεί ότι η κατανομή των συντηρημένων αμινοξέων στην επιφάνεια της δομής είναι πολωμένη με την πλειοψηφία τους να συγκεντρώνεται στην κοίλη πλευρά του τετραμερούς. Τέλος, οι αναλογίες ανάμεσα στην HrcQB-C και την πρωτεΐνη FliN του μαστιγίου φαίνεται να υποστηρίζουν την υπόθεση ότι η HrcQB-C συμμετέχει σε μια υπερμοριακή δομή σχήματος δακτυλίου ανάλογη του κυτταροπλασματικού δακτυλίου στον οποίο έχει δειχτεί ότι συμμετέχει η FliN. Στο πλαίσιο αυτό διερευνούμε πιθανούς τρόπους διευθέτησης των μορίων της HrcQB-C που να οδηγούν σε μια τέτοια δομή.
Φυσική περιγραφή 211 σ. : εικ. ; 30 εκ.
Γλώσσα Ελληνικά
Θέμα Προσδιορισμός τρισδιάστατης διαμόρφωσης πρωτείνης; Κρυσταλλογραφία ακτίνων Χ; Διάγραμμα περίθλασης ακτίνων Χ; Απομόνωση πρωτεϊνών; Κρυστάλλωση πρωτείνης; Εκκριτικό σύστημα τύπου ΙΙΙ; Παθογένεια
Ημερομηνία έκδοσης 2004-02-25
Συλλογή   Σχολή/Τμήμα--Σχολή Θετικών και Τεχνολογικών Επιστημών--Τμήμα Βιολογίας--Διδακτορικές διατριβές
  Τύπος Εργασίας--Διδακτορικές διατριβές
Εμφανίσεις 38

Ψηφιακά τεκμήρια
No preview available

Προβολή Εγγράφου
Εμφανίσεις : 8