| Περίληψη |
Η γλουταμική αφυδρογονάση (GDH) καταλύει την ανατρέψιμη οξειδωτική απαμίνωση του L-γλουταμικου οξέως, που αποτελεί τον κύριο διεγερτικό νευροδιαβιβαστή. Ο ρόλος της είναι ιδιαίτερα σημαντικός όταν στο κύτταρο υπάρχουν αυξημένη απελευθέρωση γλουταμικού οξέως ως αποτέλεσμα έντονης γλουταματεργικής δραστηριότητας και/ή ελαττωμένα επίπεδα κυτταρικής ενέργειας, καθώς περά από την απομάκρυνση του γλουταμικού οξέως, συμβάλει και στην αποκατάσταση της ενεργειακής κατάστασης του κυττάρου και την διατήρηση της ομοιόστασης της αμμωνίας του κυττάρου. Έρευνες έχουν δείξει ότι στον άνθρωπο υπάρχουν δυο ισομορφές, που διαφέρουν σε 15 μόνο αμινοξέα, που κωδικοποιούνται από δυο αντίστοιχα γονίδια, το GLUD1 που εκφράζεται σε όλους τους ιστούς και το φυλοσύνδετο GLUD2 που εκφράζεται ειδικά στο νευρικό σύστημα και στους όρχεις, και φαίνεται να προέκυψε από ρετρομετάθεση πριν από 23 εκατομμύρια χρόνια. Ανάλυση των εκφραζόμενων πρωτεϊνών, αποκάλυψε πως τα δυο ισοενζυμα παρουσιάζουν μεγάλες λειτουργικές διαφορές, ως προς την βασική τους δραστηριότητα και την ρύθμιση τους από αλλοστερικούς τροποποιητές, όπως το ADP και το GTP. Προηγούμενες μελέτες έδειξαν πως το αμινοξύ Gly456 σχετίζεται με την αντίσταση της hGDH2 στο GTP και πως το αμινοξύ Arg443 είναι υπεύθυνο για την εξάρτηση της δραστηριότητας της από το ADP. Παράλληλα, νέες ενδείξεις αποδεικνύουν ότι μία σειρά από ιδιότητες της hGDH2, όπως η μειωμένη θερμοαντοχή και η αυξημένη ευαισθησία στην αναστολή από τα οιστρογόνα, σχετίζονται με εκείνα ακριβώς τα δομικά και λειτουργικά χαρακτηριστικά, στα οποία οφείλει και την μειωμένη σε σχέση με τη hGDH1 βασική δραστηριότητα. Μελέτες 7
για πιθανή δυσλειτουργία της GDH σε ασθενείς με νευροεκφυλιστικά νοσήματα από το εργαστήριο μας έδειξαν ότι ο πολυμορφισμός Τ1492G στο γονίδιο GLUD2, ο οποίος ευθύνεται για την σημειακή αλλαγή (Ala445Ser) στην ανθρώπινη γλουταμική αφυδρογονάση (hGDH2), σχετίζεται με πρώιμη έναρξη της νόσου Πάρκινσον. Παράλληλα, φάνηκε πως η αλλαγή αυτή οδηγεί στην διαφοροποίηση της συμπεριφοράς του ενζύμου (αύξηση της βασικής δραστηριότητας εν σχέση με την φυσιολογική hGDH2) προσδίδοντας σε αυτό ιδιότητες επί πλέον λειτουργικότητας (gain of function).
Στόχοι της παρούσας διδακτορικής διατριβής ήταν η μεταλλαξιογένεση επιλεγμένων αμινοξέων της ρυθμιστικής περιοχής της GLUD2 πρωτεΐνης και η μελέτη των μεταλλαγμένων πρωτεϊνών ώστε να κατανοηθεί η μοριακή βάση ρύθμισης της βασικής δραστηριότητας του ειδικού για το νευρικό σύστημα ενζύμου. Παράλληλα με την λειτουργική ανάλυση των μεταλλαγμένων και φυσιολογικών πρωτεϊνών, πραγματοποιήθηκε μελέτη της ευαισθησίας τους σε αλλοστερικούς τροποποιητές, όπως τα οιστρογόνα (DES, estradiol, oestriol, progesterone) και τα αντιψυχωσικά (haloperidol, perphenazine). Τέλος, πραγματοποιήθηκε η μελέτη επιπλέον ασθενών με νόσο του Πάρκινσον και ισάριθμο δείγμα υγιών δεικτών της ίδιας ηλικίας για να καθοριστεί εάν η Ala445Ser μετάλλαξη είναι ειδική για την νόσο ή αποτελεί απλό πολυμορφισμό, ενώ αναζητηθήκαν πιθανοί άλλοι πολυμορφισμοί – μεταλλάξεις στο γονίδιο GLUD2 που να σχετίζονται με την νόσο του Parkinson.
Καθώς η hGDH1 έχει μελετηθεί εκτενώς (εν αντιθέσει με την hGDH2), για να μελετήσουμε περαιτέρω τους μηχανισμούς που ρυθμίζουν την λειτουργία της hGDH2, παρήγαμε με την μέθοδο της μεταλλαξιογένεσης hGDH2 μεταλλαγμένες πρωτεΐνες που φέρουν αλλαγές αμινοξέων στην ρυθμιστική περιοχή του ενζύμου (antenna, pivot helix). Τα πέντε hGDH2 μεταλλάγματα που πρόεκυψαν ήταν: τα 8
Glu441Arg, Ser445Leu στην αντένα, τα Lys450Glu, His454Tyr στην pivot helix και το Ser448Pro στην περιοχή σύνδεσης των παραπάνω δομών. Η επιλογή των παραπάνω μεταλλάξεων έγινε με κριτήριο τις ιδιότητες που προσδίδουν αντίστοιχες μεταλλάξεις της ρυθμιστικής περιοχής της hGDH1 στο ενζυμο. Τα αποτελέσματα έδειξαν πως ενώ οι μεταλλάξεις στην ρυθμιστική περιοχή της hGDH1 επηρέασαν μόνο την αναστολή από GTP, χωρίς να έχουν καμία επίδραση στη βασική δραστηριότητα του ενζύμου, οι αντίστοιχες μεταλλάξεις στο μόριο της hGDH2 επέδρασαν κυρίως στην βασική δραστηριότητα. Επομένως, παρόλο που οι hGDH1 και hGDH2 επιδεικνύουν μια μικρή μόνο δομική διαφοροποίηση, μετέχουν διαφορετικών μηχανισμών δράσης για την ρύθμιση της λειτουργίας τους.
Δεδομένου πως η hGDH2 είναι ανθεκτική στην αναστολή από GTP, μελετήθηκε η περίπτωση της αντικατάστασης της δράσης του GTP, από άλλους αλλοστερικούς τροποποιητές. Τα οιστρογόνα είναι γνωστό ότι λαμβάνουν μέρος σε μια σειρά από φυσιολογικές λειτουργίες του κυττάρου μέσω της πρόσδεσης τους σε ειδικούς υποδοχείς (ER). Εφόσον αρχικές μελέτες μας στις αγρίου τύπου GDHs, έδειξαν πως η ειδική για το νευρικό σύστημα hGDH2 ήταν πολύ πιο ευαίσθητη στην αναστολή από οιστρογόνα από την hGDH1, εξετάστηκαν επιλεγμένα μεταλλαγματα της GLUD1 προκειμένου να διερευνηθεί ο μηχανισμός με τον όποιο τα στεροειδή επιδρούν στην hGDH2. Τα αποτελέσματα μας έδειξαν πως ο μοριακός μηχανισμός με τον οποίο τα στεροειδή αναστέλλουν τις ανθρώπινες γλουταμικές αφυδρογονάσες είναι διαφορετικός από αυτόν του GTP. Έτσι, ενώ η αγρίου τύπου hGDH2 είναι ανθεκτική στην αναστολή από GTP, είναι πολύ ευαίσθητη στην αναστολή από οιστρογόνα, κατά πάσα πιθανότητα, εξαιτίας της εξελικτικής Ser443Arg αλλαγης στην ρυθμιστική περιοχή του ενζύμου. Αντίθετα, η αγρίου τύπου hGDH1, που είναι ευαίσθητη στο GTP, αποδείχθηκε αρκετά ανθεκτική στη δράση των στεροειδών.
9
Συνεπώς, ενώ το GTP λειτουργεί ως ειδικός αναστολέας για την hGDH1, τον ρόλο αυτό στην περίπτωση της hGDH2 έχουν οι στεροείδεις ορμόνες.
Με βάση προηγούμενα δεδομένα που υπήρχαν στο εργαστήριο μας, μελετήθηκε μεγαλύτερο δείγμα Παρκινσονικών ασθενών (281 ασθενείς από την Κρήτη) και υγιών ατόμων της ίδιας ηλικίας με ταυτοποίηση αλληλουχίας (sequencing) όλου το γονιδίου, προκειμένου να επιβεβαιωθεί ο ρόλος της Ser445Ala αλλαγής στο μόριο της GLUD2, καθώς και να βρεθούν άλλες πιθανές αλλαγές που να σχετίζονται με την νόσο του Πάρκινσον. Η μελέτη επιβεβαίωσε ότι η αλλαγή Ser445Ala όταν βρίσκεται σε ημίζυγη μορφή στους άνδρες σχετίζεται με την πρώιμη έναρξη της νόσου κατά 8 με 13 χρόνια σε σχέση με άνδρες και γυναίκες ασθενείς με διαφορετικό γονότυπο. Εφόσον σύμφωνα με μια θεωρία, η εμφάνιση της νόσου σχετίζεται με την αυξημένη δράση του γλουταμικού οξέως στους μετασυναπτικούς διεγερτικους υποδοχεις, τα αποτελέσματα μας υποδηλώνουν πως η παρουσία της αλλαγής αυτης, που οδηγεί στην αύξηση της δραστηριότητας του ενζύμου, επιταχύνει την νευροεκφύλιση με αποτέλεσμα την εμφάνιση της νόσου νωρίτερα.
Όταν μελετήθηκε η δράση των οιστρογόνων, αποκαλύφθηκε ότι το Ser445Ala μετάλλαγμα (που σχετίζεται με το Χ χρωμόσωμα) ήταν πολύ πιο ευαίσθητο στα οιστρογόνα από την hGDH1. Η παρατήρηση αυτή μπορεί να σημαίνει πως τα οιστρογόνα στις γυναίκες, δυνητικά εκμηδενίζουν την αύξηση της λειτουργικότητας της Ser445Ala-hGDH2 που παρατηρείται στους άνδρες, εμποδίζοντας το υπέρ-ενεργό ενζυμο να μεταβολίσει μεγάλες ποσότητες γλουταμικού οξέως, βλάπτοντας με τον τρόπο αυτό τα νευρικά κύτταρα. Έτσι, τα οιστρογόνα, με βάση την ιδιότητα που έχουν να δρουν ως ειδικοί αναστολείς της hGDH2, μπορεί να αποτελέσουν στο μέλλον το μέσο για την δημιουργία νέων θεραπευτικών αγωγών για ασθένειες που σχετίζονται με πρώιμη γήρανση και υπερέκφραση της hGDH2.
|
Ανάλυση δομής - λειτουργίας γλουταμικής αφυδρογονάσης ειδικής για το νευρικό σύστημα και γενετική προδιάθεση νόσου Πάρκινσον
