Your browser does not support JavaScript!

Αρχική    Μελέτη για την ανίχνευση των θέσεων πρόσδεσης τηςL-λευκίνης στην ανθρώπινη γλουταμική αφυδρογονάση(hGDH)  

Αποτελέσματα - Λεπτομέρειες

Προσθήκη στο καλάθι
[Προσθήκη στο καλάθι]
Κωδικός Πόρου 000370528
Τίτλος Μελέτη για την ανίχνευση των θέσεων πρόσδεσης τηςL-λευκίνης στην ανθρώπινη γλουταμική αφυδρογονάση(hGDH)
Άλλος τίτλος Characterization of L-leukine bilding sites in human glutamate dehydrogenase
Συγγραφέας Αριάνογλου, Ιωάννα
Σύμβουλος διατριβής Πλαiτάκης, Ανδρέας
Μέλος κριτικής επιτροπής Καρδάσης, Δημήτριος
Περίληψη Η γλουταμική αφυδρογονάση (GDH) καταλύει την αναστρέψιμη οξειδωτική απαμίνωση του L-γλουταμικού σε α-κετογλουταρικό και αμμωνία, χρησιμοποιώντας ως συνένζυμα NAD+ ή/και NADP+ (Smith et al, 1975). Στον άνθρωπο υπάρχουν δύο ισομορφές, η hGDHl και η hGDH2 που κωδικοποιούνται αντίστοιχα από τα γονίδια GLUD1 και GLUD2. Η GDH των θηλαστικών είναι ένα ομοεξαμερές με κάθε υπομονάδα να έχει μοριακό βάρος ~56kDa και να αποτελείται από 505 αμινοξέα. Κάθε υπομονάδα αποτελείται από τρεις βασικές περιοχές α) την περιοχή πρόσδεσης του υποστρώματος στο αμινοτελικό άκρο, β) την περιοχή πρόσδεσης του νικοτιναμιδο-αδενινο-δινουκλεοτιδίου (NAD+) ή του φωσφορικού-νικοτιναμιδο-αδενινο-δινουκλεοτιδίου (NADP+) και γ) τη ρυθμιστική περιοχή η οποία περιλαμβάνει την antenna και την περιστρεφόμενη έλικα (pivot helix). Στα θηλαστικά, η ενζυμική δραστηριότητα της GDH υπόκειται σε στενή ρύθμιση και αυτό είναι σημαντικό χαρακτηριστικό που τη διαφοροποιεί από τις υπόλοιπες γλουταμικές αφυδρογονάσες των κατώτερων εξελικτικά οργανισμών. Η ρύθμιση αυτή γίνεται μέσω αλλοστερικών τροποποιητών. Συγκεκριμένα, το ADP ενεργοποιεί το ένζυμο, διευκολύνοντας την απελευθέρωση των προϊόντων της αντίδρασης. Η L-λευκίνη είναι επίσης γνωστός ενεργοποιητής της GDH των θηλαστικών. Προσδενόμενη σε διαφορετικό σημείο από το ADP ενεργοποιεί το ένζυμο ανεξάρτητα αυτού (Fang et.al, 2002) αλλά με τρόπο συνεργιστικό (Plaitakis et al., 2000). Το GTP αντίθετα, που ενισχύει την πρόσδεση του υποστρώματος, δρα σαν αλλοστερικός αναστολέας (George and Bell, 1980). Τα δύο ανθρώπινα ισοένζυμα, hGDHl και hGDH2, στην ώριμη μορφή τους διαφέρουν μόνο σε 15 από τα 505 αμινοξέα τους. Παρόλα αυτά διαφέρουν σημαντικά ως προς την θερμοσταθερότητά τους, τη βασική τους δραστηριότητα (σε απουσία ενεργοποιητών) και την αλλοστερική ρύθμισή τους από ενεργοποιητές (ADP, L-λευκίνη) και αναστολείς (GTP, οιστρογόνα). Η hGDHl έχει βασική δραστηριότητα 35- 40% της μεγίστης, ενώ η hGDH2 έχει ~5-8% βασική δραστηριότητα, παραμένοντας όμως ευαίσθητη στην ενεργοποίηση από ADP και/ή L-λευκίνη (Shashidharan et al., 1997). Στο εργαστήριο μας έχουν εντοπιστεί με στοχευμένη μεταλλαξιογένεση τα αμινοξέα που ευθύνονται για τις κυριότερες από τις λειτουργικές διαφορές των δύο ισοενζύμων (Zaganas and Plaitakis, 2002, Zaganas et al., 2002). Συγκεκριμένα, έχει δειχθεί ότι η αλλαγή Gly456Ala καθιστά τη hGDHl ανθεκτική στην αναστολή από GTP (Zaganas and Plaitakis, 2002), ενώ καταργεί τη συνεργατικότητα αυτής της αναστολής. Η αμινοξική αντικατάσταση Arg443Ser μειώνει σημαντικά την βασική δραστηριότητα της hGDHl, επιτρέποντας ωστόσο την ενεργοποίηση από ADP και L-λευκίνη (Zaganas et al., 2002). Ο συνδυασμός των μεταλλάξεων Arg443Ser και Gly456Ala στη hGDHl αναπαράγει σε μεγάλο βαθμό τις κυριότερες ιδιότητες (βασική δραστηριότητα, αλλοστερική ενεργοποίηση από ADP και αναστολή από GTP) της hGDH2 (Kanavouras et al., 2007). Η αντικατάσταση της Arg443 από Ser στη hGDHl σχεδόν καταργεί την ευαισθησία του ενζύμου στην ενεργοποίηση από L-λευκίνη (l-l0mM) σε απουσία άλλων ενεργοποιητών, πιθανότατα επειδή διατηρεί το ένζυμο σε κλειστή διαμόρφωση και έτσι εμποδίζει την L-λευκίνη να προσδεθεί στο ενεργό κέντρο. Όταν προστίθεται ADP (0.025-O.lmM), η L-λευκίνη ενεργοποιεί το Arg443Ser hGDHl ένζυμο>2000% (Zaganas et al., 2002). Ομοίως, οι μεταλλάξεις Lys450Glu και His454Tyr της pivot helix της hGDH2 μειώνουν την βασική δραστηριότητα (κλείνοντας το ενεργό κέντρο) και την δυνατότητα ενεργοποίησης από L-λευκίνη (Kanavouras et al., 2009). Φαίνεται πως όταν το ανθρώπινο ένζυμο ευρίσκεται σε κλειστή διαμόρφωση, η L-λευκίνη δεν ασκεί την ενεργοποιητική της δράση επειδή δεν μπορεί να εισέλθει στην καταλυτική σχισμή (Kanavouras et al., 2009). Επίσης, το εύρημα ότι η απαλοιφή της αντέννας της hGDHl ή η αντικατάστασή της με εκείνη των βακτηρίων (που δεν ρυθμίζεται αλλοστερικά όπως η GDH των θηλαστικών) διατηρεί την ενεργοποίηση από L-λευκίνη, αλλά όχι την ρύθμιση από ADP και GTP (Allen et al., 2004), συμφωνεί με αυτό το μοντέλο. Το αντικείμενο της ερευνητικής αυτής μελέτης ήταν η διαλεύκανση του μοριακού μηχανισμού ρύθμισης των δύο ανθρώπινων ισοενζύμων από τη L-λευκίνη. Αναζητήθηκαν οι πιθανές θέσεις πρόσδεσης αυτής μέσω λειτουργικών μελετών. Μελετήθηκε μία σειρά από μεταλλάξεις στα cDNA GLUD1 στα σημεία που διαφέρουν οι δύο ισομορφές, καθώς επίσης και τα δύο ισοένζυμα hGDHlκαι hGDH2. Με αυτό τον τρόπο χαρτογραφήσαμε την επίδραση διάφορων μεταλλάξεων των δύο ισοενζύμων πάνω στη ενεργοποίηση από L-λευκίνη. Ευελπιστώντας να αποσαφηνίσουμε καλύτερα τόσο την περιοχή πρόσδεσης στο ένζυμο όσο και τον μηχανισμό δράσης της, τα αποτελέσματα που πήραμε δείχνουν πως το πρότυπο ενεργοποίησης από τη L-λευκίνη διαφέρει σημαντικά στις δύο ισομορφές. H hGDHl έχει υψηλότερη βασική δραστηριότητα και σε απουσία ADP ενεργοποιείται από τη L-λευκίνη σε ποσοστό ~20%, σημαντικά μικρότερο σε σχέση με το ποσοστό ενεργοποίησης της hGDH2 η οποία από μια βασική δραστηριότητα ~l0% έχει ένα ποσοστό ενεργοποίησης ~60%. Η περιοχή πρόσδεσης του γλουταμικού φαίνεται να περιέχει τις μεταλλαγές εκείνες που επηρεάζουν το πρότυπο αυτό. Η Ser174Asn (μεταλλαγή ακριβώς στην είσοδο του ενεργού κέντρου, η οποία χαρακτηρίζεται από αυξημένη βασική δραστηριότητα) σε συνδυασμό με τη Arg443Ser, φαίνεται να είναι οι δύο κυριότερες μεταλλαγές που ευθύνονται για το πρότυπο ενεργοποίησης της hGDH2. Με τα υπάρχοντα δεδομένα δεν είμαστε σε θέση να πούμε με βεβαιότητα την ακριβή θέση πρόσδεσης του αλλοστερικού αυτού τροποποιητή. Κινητικές μελέτες με την προσθήκη ADP, επιβεβαιώνουν τη συνεργατικότητα των δύο τροποποιητών και άρα την ύπαρξη ενός δεύτερου σημείου πρόσδεσης της L-λευκίνης, το οποίο πιθανώς να βρίσκεται στην ευρύτερη περιοχή γύρω από το ενεργό κέντρο. Για την εύρεση όμως της ακριβής θέσης πρόσδεσης αυτής, απαιτούνται περισσότερες μελέτες, τόσο με μεταλλαξιογένεση στη συγκεκριμένη περιοχή, όσο και με κρυσταλλογραφικές αναλύσεις.
Φυσική περιγραφή 46 σ : πιν. ; 30 εκ.
Γλώσσα Ελληνικά
Θέμα Allosteric regulation
Biochemistry
Eurymatic activity
HGDH1
HGDH2
L-Leukine
L-λευκίνη
Ευζυμική δραστηριότητα
Ημερομηνία έκδοσης 2011-04-12
Συλλογή   Σχολή/Τμήμα--Σχολή Επιστημών Υγείας--Τμήμα Ιατρικής--Μεταπτυχιακές εργασίες ειδίκευσης
  Τύπος Εργασίας--Μεταπτυχιακές εργασίες ειδίκευσης
Σημειώσεις Πρόγραμμα μεταπτυχιακών σπουδών "Νευροεπιστημών"
Εμφανίσεις 71

Ψηφιακά τεκμήρια
No preview available

Προβολή Εγγράφου
Εμφανίσεις : 15