| Περίληψη |
Τα μακροφάγα αποτελούν ευέλικτα κύτταρα του ανοσοποιητικού συστήματος με κρίσιμο
ρόλο στην άμυνα του ξενιστή, τη φλεγμονή και την επιδιόρθωση των ιστών. Ως απόκριση σε
διάφορα περιβαλλοντικά ερεθίσματα και πολωτικά σήματα, βελτιστοποιούν περαιτέρω την
γονιδιακή έκφραση για να προσαρμοστούν στις μεταβαλλόμενες συνθήκες διασφαλίζοντας
την κατάλληλη ανοσολογική απόκριση και ομοιοστασία των ιστών. Η λειτουργία και η
πλαστικότητά τους ρυθμίζονται από μια δυναμική αλληλεπίδραση μεταβολικών,
μεταγραφικών και επιγενετικών μηχανισμών. Η PHF8 είναι μια απομεθυλάση ιστονών με
Jumonji C επικράτεια, και η οποία εμπλέκεται κυρίως στη νευρωνική ανάπτυξη και στον
καρκίνο, ωστόσο ο ρόλος της στη ρύθμιση της ανοσολογικής απόκρισης και ειδικά στο
λειτουργικό προφίλ των μακροφάγων παραμένει αδιευκρίνιστος. Προηγούμενα δεδομένα
ανέδειξαν έναν αρνητικό ρόλο για το PHF8 στην κλασική ενεργοποίηση των μακροφάγων.
Μετά από διέγερση με LPS, RAW 264.7 κύτταρα με υπερέκφραση της PHF8 έδειξαν μειωμένα
επίπεδα προφλεγμονωδών δεικτών, ενώ η μείωση της έκφρασής της είχε ως αποτέλεσμα
αυξημένο προφίλ προφλεγμονώδους έκφρασης. Για την περαιτέρω μελέτη της επίδρασης της
PHF8, διερευνήσαμε άλλους πιθανούς τρόπους πρόκλησης της έκφρασής της. Αρχικά,
δείξαμε την επαγωγή έκφρασης της PHF8 σε μακροφάγα προερχόμενα από μυελό των οστών
μετά από κατεργασία με α-KG, ένα μεταβολικό ενδιάμεσο του TCA κύκλου, που εμπλέκεται
στην καθιέρωση ενός ανοσοκατασταλτικού φαινοτύπου. Επομένως, η PHF8 θα μπορούσε να
είναι ένας πιθανός μεσολαβητής του επαναπρογραμματισμού προς την Μ2 κατάσταση.
Ωστόσο, δεν ήταν εφικτό να αναπαραχθεί σε RAW 264.7 κύτταρα χρησιμοποιώντας DM-α-KG
ως ανάλογο με ευκολότερη κυτταρική διαπερατότητα. Επιπλέον, η σίγηση του Phf8 γονιδίου
σε RAW 264.7 μακροφάγα είχε ως αποτέλεσμα τον αναμενόμενο ενισχυμένο
προφλεγμονώδη φαινότυπο μετά από διέγερση με LPS, ενώ η αυξημένη έκφραση των
αντιφλεγμονωδών δεικτών Arg1 και Il10 μπορεί να λειτουργεί εξουδετερωτικά για τα υψηλά
επίπεδα προφλεγμονωδών ρυθμιστών στην αρχή της φλεγμονώδους απόκρισης. Ωστόσο, η
χαμηλή συγκέντρωση α-KG απέτυχε να προκαλέσει αύξηση στους Μ2 δείκτες και αντίστοιχη
μείωση στους Μ1 παρουσία της PHF8. Εντούτοις, ενδιαφέρον αποτελεί η πιθανή δράση του
α-KG ανεξάρτητα της PHF8 λόγω των χαμηλότερων επιπέδων των Μ2 δεικτών, Il10 και Arg1,
σε Phf8 σιγησμένα και διεγερμένα με LPS δείγματα. Προηγούμενα πειράματα έδειξαν πιθανή
επίδραση της PHF8 στη μιτοχονδριακή ρύθμιση και τη μιτοφαγία, συνεπώς αξιολογήσαμε
πώς η υπερέκφραση της PHF8 θα μπορούσε να επηρεάσει τον λειτουργικό φαινότυπο των
μιτοχονδρίων. Χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία χρώσης JC-1 και μέσω της ανάλυσης FACS,
βρέθηκε ότι ένα αυξημένο ποσοστό κυττάρων που υπερεκφράζουν την PHF8 αποκτούν
αποπολωμένα μιτοχόνδρια. Συνεχίζοντας με την σκέψη ότι η PHF8 μπορεί να ρυθμίζει τη
μιτοφαγία, αξιολογήσαμε τα πρωτεϊνικά επίπεδα του δείκτη αυτοφαγίας LC3 και την p62
(Sqstm1) “συνδετική” πρωτεΐνη, μετά από επεξεργασία με Bafilomycin A για την αναστολή
της μιτοφαγίας. Σε αντίθεση με προκαταρκτικά δεδομένα, δεν παρουσιάστηκε διαφορά στα
πρωτεϊνικά επίπεδα μεταξύ των κυττάρων ελέγχου και εκείνων που υπερεκφράζουν την PHF8
κατά την αναστολή της μιτοφαγίας, επομένως χρειάζεται περαιτέρω διερεύνηση. Λόγω της
εμπλοκής της PHF8 στην πρόοδο του κυτταρικού κύκλου, ήταν επίσης σημαντικό να
δημιουργηθεί μια νέα κυτταρική σειρά RAW 264.7 με μειωμένη έκφραση της PHF8 μέσω του
συστήματος CRISPR-Cas9 για την περαιτέρω διερεύνηση του ρόλου της στην ανοσία.
Συμπερασματικά, η παρούσα μελέτη δείχνει ότι τα επίπεδα έκφρασης της απομεθυλάσης
ιστονών PHF8 θα μπορούσαν ενδεχομένως να ενισχυθούν μέσω της κατεργασίας με α-KG,
ενώ η PHF8 μπορεί να μειώσει την προφλεγμονώδη απόκριση και να εμπλέκεται στη ρύθμιση
της μιτοχονδριακής δυναμικής, τροποποιώντας επομένως τον φαινότυπο των μακροφάγων.
|
Metabolic & epigenetic regulation during macrophage activation : the potential role of PHF8
