| Περίληψη |
Εισαγωγή: Τα Μυελοδυσπλαστικά Σύνδρομα (MDS) είναι κλονικά νοσήματα των αρχέγονων αιμοποιητικών βλαστικών κυττάρων τα οποία χαρακτηρίζονται από δυσλειτουργική αιμοποίηση στον μυελό των οστών και αυξημένο ρίσκο εξέλιξης της νόσου σε λευχαιμία. Όμως, η παθογένεια των MDS δεν περιορίζεται μόνο στα αρχέγονα αιμοποιητικά βλαστικά κύτταρα, το παθολογικό μικροπεριββάλον του Μυελού των οστών (BM) έχει δειχθεί ότι συμβάλει στην ανεπάρκεια του μυελού στους ασθενείς με MDS μέσω αναποτελεσματικής υποστήριξης της αιμοποίησης. Τα μεσεγχυματικα βλαστικά κύτταρα αποτελουν βασικά συστατικά της συστασης της αιμοποιητικής φωλιάς. Εχει δειχθεί οτι τα μεσεγχυματικά βλαστικά κύτταρα τα οποία προέρχονται από ασθενείς με MDS έχουν εγγενή λειτουργικά ελαττώματα και συνεπώς αδυνατούν να διατηρήσουν την φυσιολογική αιματοποίηση. Η αζακυτιδίνη (AZA) είναι ένας υπομεθυλιωτικός παράγοντας ο οποίος αναστελλει την τρανσφεραση μεθυλίου και χρησιμοποιείται ευρέως στην θεραπεία MDS. Παρ’ολα αυτα, η επίδραση της AZA στο μικροπεριβάλλον του μυελού των οστών και συγκεκριμένα στα μεσεγχυματικά βλαστικά κυτταρα δεν έχει μελετηθεί εκτενώς. Τα εξωκυττάρια κυστίδια ανήκουν στην οικογένεια των μεμβρανικών κυστιδίων, αποτελούνται από μια φωσφωλιπιδική διπλοστοιβάδα και εκκρίνονται στο εξωκυττάριο περιβάλλον από περίπου όλα τα κύτταρα. Τα εξωκυττάρια κυστίδια διαχωρίζονται σε 3 κύριες τάξεις οι οποίες βασίζονται στην δημιουργία και το μέγεθος των κυστιδίων: αποπτωτικά σωμάτια, μικροκυστίδια και εξωσώματα.
Σκοπός της εργασίας: Ο στόχος της εργασίας είναι η απομόνωση, η ποσοτικοποίηση και η επαλήθευση της παρουσίας των εξωσωμάτων τα οποία προέρχονται από τα μεσεγχυματικα βλαστικά κύτταρα μυελού των οστών (BM-MSCs) από ασθενείς με MDS και από υγιής δότες. Επίσης, στόχος ήταν η διερεύνηση των επιπτώσεων που έχει η θεραπεία με ΑΖΑ στα φαινοτυπικά, πολλαπλασιαστικά και διαφοροποιητικά χαρακτηριστικά των BM-MSCs προερχόμενα από ασθενείς με MDS-υψηλου κινδύνου και από υγιής δότες. Επιπρόσθετα, ακόμη ένας στόχος είναι η μελέτη της ενσωμάτωσης των εξωσωμάτων προερχόμενα από MSCs από ασθενείς με MDS και Υγιών δοτών με CD34+ και η επίδραση που έχει στην κλωνογονική ικανότητα των Αιμοποιητικών Βλαστικών Κυττάρων και συνεπώς την αιμοποιήση.
Υλικά και Μέθοδοι: BM-MSCs από ασθενείς με ΜΔΣ (ν=4), εκ των οποίων 2 είχαν μελετηθεί επίσης πριν και μετά την θεραπεία με ΑΖΑ, και από υγιής δότες (ν=3) καλλιεργήθηκαν ex vivo για 3 κυτταρικά περάσματα (P-passages) και χαρακτηρίστηκαν φαινοτυπικά μέσω κυτταρομετρητή ροής. Τα αναπτυξιακά χαρακτηριστικά των BM-MSCs αξιολογήθηκαν με την βοήθεια της μεθόδου του μεθυλο-τριαζολυλ-τετραζολίου (MTT), και η αξιολόγηση της διαφοροποιητικής ικανότητας πραγματοποιήθηκε με ιστοχημικές χρώσεις (Alizarin Red και Von Kossa για τα οστεοκύτταρα, Oil Red O για τα λιποκύτταρα) και με εκτίμηση της έκφρασης γονιδίων ειδικών για την οστεογένεση (ALP, OSC, DLX5, RUNX2) και τη λιπογένεση (PPARG, CEBPA).Κατα την διάρκεια της έρευνας αυτής καθιερώθηκε το πρωτόκολο απομόνωσης εξωσωμάτων απο την κυτταρική σειρά MDA-MB-231 μέσω διαδοχικών βημάτων υπερφυγοκέντρησης και ποσοτικοποιήθηκαν με την βοήθεια της μεθόδου BCA. Ακόμη, η επαλήθευση της παρουσίας των εξωσωμάτων πραγματοποιήθηκε μέσω της μεθοόδου Western για τις πρωτείνες αναφοράς Alix και CD9. Για την μελέτη επίδρασης των εξωσωμάτων στην κλωνογονική ικανότητα των Αιμοποιητικών Βλαστικών Κυττάρων πραγματοποιήθηκε συν-καλλιέργεια μεταξύ εξωσωμάτων από 3 τυχαία δείγματα BM-MSCs μαζί με CD34+ κύτταρα και παρατηρήθηκε ο αριθμός των αποικειών που δημιουργήθηκαν.
Αποτελέσματα: Μέχρι στιγμής τα αποτελέσματα μας έχουν δείξει ότι τα καλλιεργούμενα MSCs από MDS-ασθενείς πριν και μετά την θεραπεία με ΑΖΑ παρουσίασαν παρόμοια μορφολογικά χαρακτηριστικά συγκριτικά με τα MSCs υγιών δοτών, καθώς και οι δύο διατήρησαν το χαρακτηριστικό σχήμα του ινοβλάστη. Η μελέτη των ανοσοφαινοτυπικών χαρακτηριστικών των MDS-MSCs έδειξε ότι εκφράζουν τους αναμενόμενους δείκτες επιφάνειας που αναμένονται στα MSCs, με καμιά διαφορά πριν και μετά την θεραπεία με ΑΖΑ. Ακόμη, κάποια πρώιμα αποτελεσματα υποδεικνύουν ότι η πολλαπλασιαστική ικανότητα των MDS-MSC πριν και μετά την θεραπεία με ΑΖΑ in vivo φαίνεται να είναι παρόμοια, σε αντίθεση με την θεραπεία με ΑΖΑ in vitro η οποία φαίνεται να μειώνει το δυναμικό πολλαπλασιασμού των MDS-MSC. Η ικανότητα διαφοροποίησης των MDS-MSC προς οστεοκύτταρα και λιποκύτταρα όπως έχει φανεί στις χρώσεις δεν παρουσίασε κάποια μορφολογική διαφορά μεταξύ πριν και μετά την θεραπεία με ΑΖΑ. Παρ’ όλα αυτά, η έκφραση γονιδιών των MDS-MSC πριν την θεραπεία με ΑΖΑ έδειξε ότι τα γονίδια σχετιζόμενα με την λιπογένεση ήταν αυξημένα, ενώ η έκφραση των γονιδίων σχετιζόμενα με την οστεογένεση ήταν παρόμοια με την έκφραση των MDS-MSC μετά την θεραπεία με ΑΖΑ, αλλά όχι στατιστικά σημαντικά. Από την άλλη πλευρά, η εκτίμηση των επιπέδων έκφρασης για τα συγκεκριμένα γονίδια έδειξε ότι τα BM-MSC από υγιείς δότες υπερέχουν στην ικανότητά τους να διαφοροποιούνται σε λιποκύτταρα και οστεοκύτταρα σε σύγκριση με τα MDS-MSCs ανεξάρτητα από τη θεραπεία με ΑΖΑ. Επιπλέον, κατά τη διάρκεια της μελέτης, καθιερώθηκε η απομόνωση των εξωσωμάτων που προέρχονται από την κυτταρική σειρά MDA-MB-231 χρησιμοποιώντας υπερφυγοκέντρηση και τα απομονωμένα εξωσώματα επιβεβαιώθηκαν με την έκφραση των πρωτεϊνών Alix και CD9. Συγκαλλιέργειες εξωσωμάτων που προέρχονται από τυχαία δείγματα MSCs με κύτταρα CD34+ υγιών δοτών έδειξαν ότι η ενσωμάτωση εξωσωμάτων σε κύτταρα CD34 + δεν είχε σημαντική επίδραση στην κλωνογονική ικανότητα των κυττάρων CD34+ σε σύγκριση με τον αριθμό των αποικιών σχηματισμού δειγμάτων ελέγχου CD34+ (απουσία εξωσωμάτων).
Συμπεράσματα: Συμπερασματικά, όλα τα πειράματα είναι ακόμη σε εξέλιξη και χρειάζονται πολλά ακόμη για να επιτευχθεί ένα έγκυρο αποτέλεσμα, αλλά μέχρι στιγμής, φαίνεται ότι η θεραπεία με AZA in vivo με την παρουσία του αυξητικού παράγοντα (FGF-2) δεν έχει στατιστικά σημαντική επίδραση στον πολλαπλασιασμό των MDS-MSC, αυξάνει το δυναμικό διαφοροποίησης των MDS-MSC σε λιποκύτταρα και διατηρεί το οστεογονικό δυναμικό των MSC σε σύγκριση με το MDS-MSC πριν από τη θεραπεία με AZA. Περαιτέρω έρευνα σε MDS-MSCs πριν και μετά τη θεραπεία με Azacytidine χρειάζεται για να καταστήσει τον μηχανισμό δράσης του AZA πιο κατανοητό ενώ θα παρέχει νέα δεδομένα για την παθοφυσιολογία των MDS, οδηγώντας έτσι σε μια καλύτερη θεραπευτική προσέγγιση.
Επιπλέον, επιτεύχθηκε η τυποποίηση της απομόνωσης εξωσωμάτων, της ποσοτικοποίησης και της επαλήθευσης της παρουσίας. Ωστόσο, παρόλο που τα εξωκυτταρικά κυστίδια έχουν γίνει το επίκεντρο μεγάλου ενδιαφέροντος, εξακολουθούν να υπάρχουν σημαντικά εμπόδια που πρέπει να ξεπεραστούν ώστε να βελτιστοποιηθεί η κλινική τους χρήση.
|
Exosomes derived from Bone Marrow Mesenchymal Stem/Stromal Cells of patients with Myelodysplastic syndromes : Investigation of their role in hematopoiesis.
