| Περίληψη |
Το διαμέρισμα μεταξύ της εξωτερικής και της εσωτερικής μεμβράνης των μιτοχονδρίων που ονομάζεται διαμεμβρανικός χώρος (IMS) φέρει πολλές διαφορετικές πρωτεΐνες που περιέχουν δισουλφιδικούς δεσμούς στη δομή τους. Πρόσφατα, ένα σύστημα οξειδοαναγωγής δισουλφιδίων στον διαμεμβρανικό χώρο έχει ταυτοποιηθεί στο οποίο παίζουν σημαντικό ρόλο δύο ζωτικής σημασίας πρωτεΐνες, η σουλφυδριλοξειδάση Erv1 και ο υποδοχέας εισόδου πρωτεϊνών-υποστρωμάτων που ρυθμίζεται οξειδοαναγωγικά, Mia40/Tim40. Αυτό το σύστημα οξειδοαναγωγής, που ονομάζεται Mia40-Erv1 μονοπάτι, οδηγεί την είσοδο πλούσιων σε κυστεϊνες πρωτεϊνών στο IMS των μιτοχονδρίων μέσω ενός μηχανισμού οξειδωτικής αναδίπλωσης.
Στην παρούσα εργασία, στόχος ήταν η εύρεση πιθανών νέων υποστρωμάτων της οξειδάσης σουλφυδριλίων Erv1, η οποία όπως προαναφέρθηκε βρίσκεται στο διαμεμβρανικό χώρο των μιτοχονδρίων του σακχαρομύκητα Saccharomyces cerevisiae. Με την πραγματοποίηση βιοχημικών πειραμάτων, όπως χρωματογραφία αποκλεισμού μεγέθους και πρόσδεσης της πρωτεΐνης αυτής ως σημασμένη με ιστιδίνες στο καρβοξυτελικό της άκρο, σε σφαιρίδια νικελίου, δείχνουμε ότι το σύμπλοκο το οποίο φαίνεται να απομονώνεται από τα μιτοχόνδρια του στελέχους Erv1His του σακχαρομύκητα είναι μοριακού βάρους περίπου 70kDa. Αυτό το μοριακό βάρος είναι πιθανό να αφορά το διμερές της Erv1 ή κάποιο σύμπλοκο αυτής με μια πρωτεΐνη παρόμοιου μοριακού μεγέθους καθώς από τα πειραματικά δεδομένα δεν φαίνεται να περιλαμβάνει τις πρωτεΐνες Mia40 και κυτόχρωμα c (cytc), δύο πρωτεΐνες οι οποίες αλληλεπιδρούν με την Erv1 πρωτεΐνη. Παράλληλα, έγινε μια προσπάθεια ποσοτικοποίησης των πρωτεϊνών Erv1, Mia40 και κυτόχρωμα c σε μιτοχόνδρια αγρίου τύπου του σακχαρομύκητα κάτω από φυσιολογικές συνθήκες. Το αποτέλεσμα έδειξε ότι ενώ το κυτόχρωμα c φαίνεται να βρίσκεται σε μεγαλύτερη ποσότητα ανά mg μιτοχονδρίων συγκριτικά με τις άλλες δύο πρωτεΐνες, η πρωτεΐνη Mia40 φαίνεται να υπάρχει σε υποστοιχειομετρική ποσότητα συγκριτικά με την πρωτεΐνη Erv1, η οποία είναι γνωστό ότι οξειδώνει την Mia40 ανακυκλώνοντάς την με αυτόν τον τρόπο. Ακόμα, μελετήσαμε την αλληλεπίδραση των πρωτεϊνών Erv1 και Mia40 σε δύο στάδια: κατά την είσοδο της πρωτεΐνης Erv1 ως υπόστρωμα της πρωτεΐνης Mia40 και σε ένα δεύτερο στάδιο την αλληλεπίδρασή τους από τη στιγμή ix
που η Erv1 αναδιπλωθεί στο διαμεμβρανικό χώρο του μιτοχονδρίου και γίνει λειτουργική. Φαίνεται ότι κάποια υδρόφοβα αμινοξέα στη καρβοξυτελική πλευρά του κυστεϊνικού μοτίβου CRSC της αγρίου τύπου Erv1 του σακχαρομύκητα (yErv1) είναι σημαντικά για το σχηματισμό του “Μia40-Εrv1” μικτού δισουλφιδικού ενδιάμεσου ενώ δεν είναι σημαντικά για την είσοδο της πρωτεΐνης αυτής ως υπόστρωμα στο διαμεμβρανικό χώρο και επομένως την αναγνώρισή της από την πρωτεΐνη Mia40. Τέλος, προσπαθήσαμε να δουλέψουμε με το ανθρώπινο ορθόλογο της Erv1, την πρωτεΐνη hALR, η οποία έχει δύο ισομορφές την μεγάλου μήκους (long form, lf) και τη μικρού μήκους (short form, sf). Πολλά από τα εργαλεία δουλειάς για τη μελέτη των συγκεκριμένων πρωτεϊνών σε μιτοχόνδρια του σακχαρομύκητα έχουν στηθεί για την απάντηση πολλών και σημαντικών ερωτημάτων σε αυτό το ετερόλογο σύστημα.
|
Μελέτη της σουλφυδριλοξείδασης Erv1 στο μιτοχόνδριο του σακχαρομύκητα S. cerevisiae
