| Περίληψη |
Το ανοσοποιητικό σύστημα εξελίχθηκε για να προστατεύει το σώμα από ξένα εισβάλλοντα παθογόνα.
Κάτω όμως από συγκεκριμένες παθολογικές καταστάσεις η ανοσολογική ανοχή χάνεται και το ανοσοποιητικό
σύστημα επιτίθεται στον «εαυτό» προκαλώντας βλάβη σε διάφορους ιστούς και όργανα, κατάσταση η οποία
χαρακτηρίζει την αυτοανοσία. Ο Σ υστηματικός Ερυθηματώδης Λύκος (Σ.Ε.Λ.) αποτελεί το πρωτότυπο
αυτοάνοσο νόσημα που χαρακτηρίζεται κυρίως από υπερενεργοποιημένα Β-λεμφοκύτταρα, παραγωγή
αυτοαντισωμάτων και απρόσφορη ενεργοποίηση του ανοσοποιητικού συστήματος οδηγώντας σε χρόνια
φλεγμονή.
Μεταξύ των διαφόρων συστημάτων που προσβάλλονται στο Σ.Ε.Λ. είναι το αγγειακό σύστημα και οι
καρδιαγγειακές διαταραχές αποτελούν μείζονα αιτία νοσηρότητας και θνησιμότητας κατά τη διαδρομή της
νόσου. Οι ασθενείς με Σ.Ε.Λ. χαρακτηρίζονται από πρώιμη και επιταχυνόμενη αθηροσκλήρωση που δεν
ερμηνεύεται πλήρως από τους παραδοσιακούς παράγοντες κινδύνου κατά Framingham. Για το λόγο αυτό
έχουν προταθεί διάφοροι, μη παραδοσιακοί, παράγοντες κινδύνου όπως η συστηματική φλεγμονή, η
παραγωγή αντι-ενδοθηλιακών αυτοαντισωμάτων, επίθεση στο ενδοθήλιο από αυτοδραστικά Τ-λεμφοκύτταρα
και ανισορροπία μεταξύ ενδοθηλιακής βλάβης και επιδιόρθωσης που οδηγούν τελικά σε ενδοθηλιακή
δυσλειτουργία που μπορεί να αναγνωριστεί τόσο κλινικά όσο και βιολογικά με τη χρήση κυτταρικών δεικτών
όπως ο αυξημένος αριθμός κυκλοφορούντων ενδοθηλιακών κυττάρων (CECs) και ο μειωμένος αριθμός
ενδοθηλιακών προγονικών κυττάρων (EPCs) στο αίμα ασθενών με Σ.Ε.Λ.
Η αθηροσκλήρωση σήμερα θεωρείται ως φλεγμονώδης και αυτοάνοση νόσος με συμμετοχή της
φυσικής και της επίκτητης ανοσίας. Το εναρκτήριο γεγονός στην ανάπτυξη της αθηροσκλήρωσης είναι η
ενδοθηλιακή δυσλειτουργία που ακολουθείται από κινητοποίηση φλεγμονωδών και ανοσολογικών μηχανισμών
και περαιτέρω επέκταση οφειλόμενη σε φλεγμονώδη νεοαγγειογένεση.
Αν και ποικίλοι μηχανισμοί έχουν προταθεί, η ακριβής αιτιολογία της εκτεταμμένης αγγειοπάθειας στο
Σ.Ε.Λ. παραμένει αδιευκρίνιστη. Σηματοδοτικά μονοπάτια στα ενδοθηλιακά κύτταρα που ενεργοποιούνται ή
επηρεάζονται από τη δράση του ανοσοποιητικού συστήματος αποτελούν εξαιρετικές υποψηφιότητες.
Το συνδιεγερτικό μόριο CD40 εκφράζεται σε διάφορους κυτταρικούς πληθυσμούς όπως τα Β-
λεμφοκύτταρα, τα μονοκύτταρα/μακροφάγα και τα ενδοθηλιακά κύτταρα. Η σηματοδότηση του μορίου μετά
την πρόσδεση του συνδέτη του, του CD154 (CD40L), στα ανοσοποιητικά κύτταρα απαιτείται για την ανάπτυξη
αποτελεσματικής χυμικής αλλά και κυτταρικής ανοσίας ενώ στα ενδοθηλιακά κύτταρα και τα μονοκύτταρα
επάγει προφλεγμονώδη φαινόμενα, επιταχύνει την ανάπτυξη της αθηροσκλήρωσης και κινητοποιεί
απρόσφορες αγγειογενείς αποκρίσεις λόγω της υπερπαραγωγής αυξητικού παράγοντα του αγγειακού
ενδοθηλίου (VEGF). Η συμμετοχή του γονιδίου CD40 στο Σ.Ε.Λ. δεν έχει επιβεβαιωθεί, ωστόσο η εμμένουσα
έκφραση του CD40L από Τ-λεμφοκύτταρα και αιμοπετάλια και αυξημένα επίπεδα διαλυτού CD40L στο πλάσμα
ασθενών με Σ.Ε.Λ, μπορεί να ενεργοποιήσει πολυάριθμα κύτταρα.
Ο VEGFR2 εκφράζεται κυρίως στα ενδοθηλιακά κύτταρα, μεταβιβάζει τα βασικότερα
προαγγειογενετικά σήματα και ρυθμίζει τις βασικές βιολογικές ιδιότητες των ενδοθηλιακών κυττάρων. Η δράση
του επιτυγχάνεται μετά από πρόσδεση του συνδέτη του, του VEGF, ο οποίος παράγεται από ενδοθηλιακά
κύτταρα, μονοκύτταρα, ινοβλάστες και λεία μυϊκά κύτταρα ως απόκριση στην υποξία που αποτελεί το κύριο
φυσιολογικό σήμα για την έναρξη της αγγειογένεσης. Κάτω από παθολογικές καταστάσεις όπως για
παράδειγμα η χρόνια φλεγμονή, ο VEGF παράγεται και από άλλους τύπους κυττάρων όπως τα νεοπλασματικά
κύτταρα και τα ενεργοποιημένα Τ-λεμφοκύτταρα και επάγει φλεγμονώδη νεοαγγειογένεση ρυθμίζοντας τον
υποδοχέα VEGFR-2 με ένα μηχανισμό θετικής επανατροφοδότησης οδηγώντας στην υπερέκφραση του.
Νεοαγγειογένεση παρατηρείται στις εκτεταμένες αθηροσκληρωτικές πλάκες και θεωρείται υπεύθυνη για τις
αιμορραγίες εντός της πλάκας, την αστάθεια και τελικά τη ρήξη τους. Ο VEGFR2 έχει συσχετισθεί με αγγειακές
νόσους όπως η στεφανιαία νόσος και γενετικές μεταλλάξεις του έχουν βρεθεί σε αγγειακούς όγκους αλλά
παραμένει άγνωστη η πιθανή συσχέτιση του με το Σ.Ε.Λ.
Λαμβάνοντας υπόψη την ενδοθηλιακή έκφραση του CD40 και του VEGFR2, τον περιγεγραμμένο ρόλο
τους στις άνοσες αποκρίσεις και την ενδοθηλιακή βιολογία και την πιθανή διασταυρούμενη αλληλεπίδραση των
μονοπατιών τους, διερευνήσαμε γενετικά μέσω πολυμορφισμών την πιθανή συμμετοχή των γονιδίων στην
παθογένεια του Σ.Ε.Λ.
Για τις μελέτες γενετικής συσχέτισης, το πρωτογενές δείγμα αποτελούνταν από 351 ασθενείς με Σ.Ε.Λ.
και 670 υγιείς μάρτυρες, όλοι Ελληνικής καταγωγής. Χρησιμοποιήθηκαν 158 ασθενείς με Σ.Ε.Λ. και 155 υγιείς
μάρτυρες από την Τουρκία ως δείγμα επαλήθευσης. Η γονοτύπηση για τον rs4810485 μονονουκλεοτιδικό
πολυμορφισμό (που έχει ήδη συσχετιστεί με ρευματοειδή αρθρίτιδα) πραγματοποιήθηκε με RFLPs και την
τεχνολογία Sequenom MassArray. Η έκφραση του CD40 mRNA και πρωτεΐνης εκτιμήθηκε σε βασικές συνθήκες
και μετά από αντιγονική διέγερση με LPS σε μονοπύρηνα κύτταρα περιφερικού αίματος με ποσοτική Real-Time
PCR και κυτταρομετρία ροής. Τα CD45 αρνητικά κύτταρα απομονώθηκαν από το περιφερικό αίμα και ο
συνολικός αριθμός της υποομάδας των CECs καθώς και η έκφραση του CD40 σε αυτά εκτιμήθηκε επίσης με
κυτταρομετρία ροής.
Οι V297I (rs2305948) και Q472H (rs1870377) μονονουκλεοτιδικοί πολυμορφισμοί στο VEGFR2
γονοτυπήθηκαν με τεχνολογία Taqman και RFLPs σε 150 ασθενείς με Σ.Ε.Λ. και 96 υγιείς μάρτυρες. Τα CECs
απομονώθηκαν από το περιφερικό αίμα με αντι-CD146 σημασμένα μαγνητικά σφαιρίδια και μετρήθηκαν μετά
από χρώση τους με TRITC-σημασμένη Ulex Europaeus Aglutinin-1 σύμφωνα με το δημοσιευμένο πρωτόκολλο
συμφωνίας. Η απεικόνιση του V297I βασίστηκε στο τρισδιάστατη δομή των D2 και D3 δομικών περιοχών του
VEGFR-2 σε σύμπλοκο με τον VEGF-C. Η αντιστοίχιση της αλληλουχίας της D5 περιοχής του VEGFR2
πραγματοποιήθηκε με την αλληλουχία του c-KIT (επίσης υποδοχέας κινάσης τυροσίνης) ακολουθούμενη από
ανάλυση ομολογίας της εξωκυττάριας περιοχής του ΚΙΤ, προκειμένου να διερευνηθεί ο πολυμορφισμός
Q472H.
Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι το έλασσον αλληλόμορφο Τ του rs4810485 μονονουκλεοτιδικού
πολυμορφισμού στο CD40 υποαντιπροσωπεύεται σημαντικά στους Έλληνες ασθενείς με Σ.Ε.Λ. συγκριτικά με
τους υγιείς μάρτυρες. Η συσχέτιση επαληθεύτηκε στην Τουρκική ομάδα μελέτης και παρέμεινε ισχυρή στη
μεταανάλυση 509 ασθενών με Σ.Ε.Λ. και 825 υγιών μαρτύρων. Τόσο σε ασθενείς όσο και σε μάρτυρες, οι
rs4810485 G/T και T/T γονότυποι σχετίζονταν με σημαντικά χαμηλότερη έκφραση του CD40 σε επίπεδο RNA
και πρωτεΐνης στα B-λεμφοκύτταρα και μονοκύτταρα τόσο σε βασικές συνθήκες όσο και μετά από αντιγονική
διέγερση σε σχέση με το G/G γονότυπο. Οι G/T και T/T γονότυποι σχετίζονταν επίσης με σημαντικά
χαμηλότερο συνολικό αριθμό αλλά και CD40+ CECs αλλά και χαμηλότερη επιφανειακή έκφραση του CD40
συγκριτικά με το G/G γονότυπο.
Το έλασσον αλληλόμορφο Α του VEGFR2 rs18703077 πολυμορφισμού ήταν σημαντικά συχνότερο
στους ασθενείς με Σ.Ε.Λ. σε σχέση με τους μάρτυρες ενώ και η παρουσία του ομόζυγου γονοτύπου A/A ήταν
επίσης σημαντικά συχνότερη στους ασθενείς. Δεν ανιχνεύθηκε συσχέτιση με το Σ.Ε.Λ. για τον πολυμορφισμό
rs2305948. Μεταξύ των ασθενών με τον A/A γονότυπο, ο αριθμός CECs ήταν σημαντικά υψηλότερος σε
σχέση με τον Τ/Τ γονότυπο. Η απεικόνιση της μεταλλαγής έδειξε ότι η θέση 472 που βρίσκεται στην 5η Ig-like
περιοχή του εξωκυττάριου τμήματος του VEGFR2 και επηρεάζει την αποτελεσματικότητα της trans-
αυτοφωσφορυλίωσης του υποδοχέα και πιθανά την ενεργοποίηση του.
Τα αποτελέσματα καθιστούν το CD40 ως γενετικό παράγοντα κινδύνου για Σ.Ε.Λ. Το έλασσον
αλληλόμορφο Τ του rs4810485 που υποαντιπροσωπεύεται στο Σ.Ε.Λ. συσχετιζόταν με χαμηλότερη έκφραση
CD40 στα Β-λεμφοκύτταρα, μονοκύτταρα και ενδοθηλιακά κύτταρα. Το γεγονός αυτό υποδηλώνει ότι μία
μεγάλη υποομάδα των ασθενών που φέρουν το αλληλόμορφο G, χαρακτηρίζεται από υψηλότερες εκφράσεις
CD40 τόσο στα κύτταρα του ανοσοποιητικού συστήματος όσο και στα ενδοθηλιακά κύτταρα καθώς επίσης και
από αυξημένο αριθμό CECs στο αίμα, ενδεικτικό ενδοθηλιακής βλάβης. Τα ευρήματα αυτά υποδηλώνουν ότι
στους ασθενείς αυτούς η σηματοδότηση του CD40 μπορεί να είναι ενισχυμένη στα κύτταρα στόχους και
μπορεί να έχει συνέπειες τόσο στην απρόσφορη ανοσορύθμιση αλλά και στην ενδοθηλιακή λειτουργία
προκαλώντας βλάβη είτε άμεσα μέσω της σηματοδότησης στα ενδοθηλιακά κύτταρα είτε έμμεσα μέσω της
ενίσχυσης των αντι-ενδοθηλιακών άνοσων αποκρίσεων.
Ο πολυμορφισμός Q472H και η ισχυρή συσχέτιση του με το Σ.Ε.Λ. καθιστά το μόριο ως υποψήφιο για
τη συμμετοχή του στην παθογένεια της νόσου. Η περαιτέρω ανάλυση του αριθμού των CECs υποδηλώνει ότι
ο υπεραντιπροσωπευόμενος A/A γονότυπος μπορεί να σχετίζεται άμεσα με ενδοθηλιακή βλάβη ενώ τα δομικά
δεδομένα υποδηλώνουν ότι, ανεξαρτήτως συσχέτισης με το νόσημα, και οι δύο πολυμορφισμοί που
μελετήθηκαν μπορεί να προκαλούν ενδοθηλιακή βλάβη λόγω διαταραχών στη σηματοδότηση του μορίου.
Συνολικά, τα αποτελέσματα μας εμπλέκουν το CD40 και το VEGFR2 στην παθογένεια του Σ.Ε.Λ. και
παρέχουν περαιτέρω προεκτάσεις που μπορεί να αφορούν και την ενδοθηλιακή βιολογία και αγγειογένεση. Μία
πολύ ελκυστική εικασία με βάση τα αποτελέσματα και τη βιβλιογραφικά βασιζόμενη ερμηνεία τους είναι ότι
επιπρόσθετα των διαταραχών στην ασοσοπαθογένεια του Σ.Ε.Λ., η σηματοδότηση του CD40 στα Β-
λεμφοκύτταρα και μονοκύτταρα μπορεί να προκαλέσει και εκτεταμένη ενδοθηλιακή βλάβη λόγω
υπερπαραγωγής αντι-ενδοθηλιακών αντισωμάτων και υπερενεργοποίησης των μονοκυττάρων με αύξηση της
προσκόλλησης στα ενδοθηλιακά κύτταρα και υπερπαραγωγή VEGF. O αυξημένος VEGF προσδενόμενος σε ένα
υποδοχέα με πιθανά διαταραγμένη σηματοδότηση, μπορεί περαιτέρω να επηρεάσει την ενδοθηλιακή
ακεραιότητα. Ο καθαρά υποθετικός αυτός μηχανισμός μπορεί να λειτουργήσει ως «υπόθεση εργασίας» που
πρέπει να ελεγχθεί πειραματικά.
|
Γενετική ανάλυση της αγγειογένεσης στο συστηματικό ερυθηματώδη λύκο : γονιδιακοί πολυμορφισμοί σε ειδικά μόρια του ενδοθηλίου και η συμβολή τους στη μελέτη της ενδοθηλιακής βιολογίας και της αγγειογένεσης
