| Περίληψη |
Πολλά στελέχη που ανήκουν στο γένος Pseudomonas χρησιμοποιούνται ευρέως προκειμένου να μελετηθούν οι προσαρμοστικοί μηχανισμοί που αναπτύσσονται, σε σχέση με την ανθεκτικότητά τους έναντι τοξικών συγκεντρώσεων οργανικών διαλυτών αρωματικής κυρίως σύστασης στα κατά Gram αρνητικά βακτήρια όταν χρησιμοποιούν τις ενώσεις αυτές ως μοναδική πηγή άνθρακα. Το βακτηριακό στέλεχος phDV1 του γένους Pseudomonas απομονώθηκε από λύματα διυλιστηρίων σε βιομηχανική περιοχή της Δανίας και το κύριο χαρακτηριστικό του είναι το γεγονός ότι αναπτύσσεται καταναλώνοντας αποτελεσματικά τη φαινόλη ως μοναδική πηγή άνθρακα. Προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει ότι η βιοαποικοδόμηση της φαινόλης πραγματοποιείται μέσω του meta μεταβολικού μονοπατιού όταν αυτή χρησιμοποιείται ως μοναδική πηγή άνθρακα και ενέργειας. Επιπλέον, πρόσφατες μελέτες έχουν πραγματοποιηθεί για το μεμβρανικό κλάσμα του βακτηριακού αυτού στελέχους, οι οποίες έχουν οδηγήσει στην ταυτοποίηση των επαγόμενων πρωτεϊνών με πηγές άνθρακα τη φαινόλη, τη σουκρόζη είτε το LB, χρησιμοποιώντας ηλεκτροφόρηση δύο διαστάσεων υπό αποδιατακτικές συνθήκες . Τα αποτελέσματα που προκύπτουν παρέχουν πληροφορίες οι οποίες περιορίζονται κυρίως στο ποιες είναι οι εκάστοτε πρωτεΐνες που συνιστούν το υπό μελέτη κυτταρικό διαμέρισμα, ενώ μπορεί κανείς να πάρει ελάχιστες πληροφορίες σχετικά με τη λειτουργία των πρωτεϊνών. Μια ενδιαφέρουσα προσέγγιση είναι να μελετήσει κανείς τις αλληλεπιδράσεις μεταξύ των πρωτεϊνών έτσι ώστε να γίνει κατανοητή η λειτουργία τους αλλά και ο μοριακός τους μηχανισμός. Πιο συγκεκριμένα, στις κυτταρικές μεμβράνες, πολλές καλά χαρακτηρισμένες πρωτεΐνες αλληλεπιδρούν μέσω συμπλόκων τα οποία επιτελούν σημαντικές λειτουργίες όπως είναι η παραγωγή ενέργειας και η μεταφορά των μορίων.
Οι αλληλεπιδράσεις μεταξύ των πρωτεϊνών είναι καθοριστικής σημασίας , αν όχι για όλες , για ένα μεγάλο αριθμό βιολογικών λειτουργιών, καθώς οι πρωτεΐνες που αλληδρεπιδούν μεταξύ τους τις περισσότερες φορές συνιστούν ένα σύμπλοκο. Η μελέτη των μεμβρανικών συμπλόκων του κυττάρου αποτελεί σημαντικό βήμα για την κατανόηση των κυτταρικών λειτουργιών. Στην παρούσα εργασία μελετήθηκε το στέλεχος Pseudomonas phDV1, ένα κατά Gram αρνητικό το οποίο επιλέχθηκε για την ικανότητά του να αποικοδομεί αρωματικές ενώσεις, όπως αναφέρθηκε. Χρησιμοποιήθηκαν ως πηγές άνθρακα φαινόλη, σουκρόζη ή LB (lysogeny Broth), όπου και μελετήθηκαν τα μεμβρανικά πρωτεϊνικά σύμπλοκα κάτω από αυτές τις τρεις διαφορετικές συνθήκες ανάπτυξης. Τα διαδοχικά βήματα που ακολουθήθηκαν είναι: (α) δύο βήματα «πλυσίματος» των μεμβρανών με 5mΜ EDTA και 0,1% sodium-N-lauryl sarcosinate, διαδικασία η οποία απομακρύνει τις υδατοδιαλυτές πρωτεΐνες που αλληλεπιδρούν με τη μεμβράνη, (β) διαχωρισμός των μεμβρανικών πρωτεϊνικών συμπλόκων χρησιμοποιώντας μίας διάστασης ηλεκτροφόρηση σε gel πολυακρυλαμιδίου υπό μη αποδιατακτικές συνθήκες (BN-PAGE) κατόπιν διαλυτοποίησης του μεμβρανικού κλάσματος με το απορρυπαντικό n-dodecyl-β-maltoside (DDM), (γ) δύο διαστάσεων ηλεκτροφόρηση - συνδυασμός του BN-PAGE με Tricine-SDS-PAGE, (δ) ταυτοποίση πρωτεϊνικών στιγμάτων κατόπιν θρυψινοποίησης τους με φασματοσκοπία μάζας χρησιμοποιώντας τη μεθοδολογία MALDI TOF/TOF. Συμπερασματικά, ταυτοποιήθηκαν ορισμένα πρωτεϊνικά μεμβρανικά σύμπλοκα για τις τρεις διαφορετικές πηγές άνθρακα, ενώ εντοπίστηκαν διαφορές μεταξύ των τριών διαφορετικών πηγών κυρίως για πρωτεΐνες που απαντώνται στην εξωτερική μεμβράνη του στελέχους Pseudomonas phDV1.
|
Μελέτη του μεμβρανικού κλάσματος του βακτηρίου Pseudomonas sp. phDV1 με μεθόδους πρωτεομικής ανάλυσης
