| Περίληψη |
Η πεπτιδογλυκάνη είναι ένα μακρομόριο από μακριές αλυσίδες εναλλασόμενων μονάδων σακχάρων GlcNAc-MurNAc συνδεδεμένων μέσω β-1,4-Ν- γλυκοζιτικών δεσμών, που αποτελεί απαραίτητο συστατικό του βακτηριακού κυτταρικού τοιχώματος. Υπόκειται σε τροποποιήσεις της δομής της, όπως είναι η N-απακετυλίωση της πεπτιδογλυκάνης από τις απακετυλάσες της Ν-ακετυγλυκοζαμίνης, η οποία επηρεάζει την αναγνώριση του βακτηρίου από τα κύτταρα του ανοσοποιητικού συστήματος του ξενιστή, ενώ επίσης το καθιστά ανθεκτικό στη δράση της λυσοζύμης. Οι απακετυλάσες της Ν-ακετυλογλυκοζαμίνης ανήκουν στην οικογένεια 4 των εστερασών υδατανθράκων (CE4), η οποία περιλαμβάνει τις απακετυλάσες της Ν-ακετυλογλυκοζαμίνης της πεπτιδογλυκάνης (EC 3.1.1.-), τις απακετυλάσες των χιτοολιγοσακχαριτών της NodB των ριζόβιων (EC 3.5.1.-), τις απακετυλάσες χιτίνης (EC 3.5.1.41), τις εστεράσες ακετυλοξυλάνης (EC 3.1.1.72), και τις ξυλανάσες A, C, D και Ε (EC 3.2.1.8). Τα μέλη αυτής της οικογένειας εμφανίζουν σημαντική ομολογία μεταξύ τους και περιλαμβάνουν εκτός από την πολύ καλά συντηρημένη επικράτεια ομολογίας NodB, μια συντηρημένη τριάδα αμινοξικών καταλοίπων δέσμευσης μετάλλου (Asp, His, His), ένα συντηρημένο καταλυτικό κατάλοιπο Asp στο ενεργό κέντρο, και μια συντηρημένη υδροξυλιωμένη Pro στο άτομο Cα (2-Hyp), που εντοπίζονται στην επικράτεια NodB. Ο μέχρι σήμερα αποδεκτός καταλυτικός μηχανισμός αυτών των μεταλλο-εξαρτώμενων ενζύμων βασίζεται στο μηχανισμό αντίδρασης οξέος-βάσης. Τα γονιδιώματα του Bacillus cereus ATCC 14579 καθώς και του στενού συγγενή του Bacillus anthracis (90% ομολογία), περιέχουν από 11 γονίδια που κωδικοποιούν για απακετυλάσες πολυσακχαριτών, εκ των οποίων οι 6 φαίνεται να κωδικοποιούν πιθανές απακετυλάσες της Ν-ακετυλογλυκοζαμίνης που είναι υψηλά ομόλογες. Μεταξύ αυτών των 6 απακετυλάσων βρίσκεται και η BC2929 του Bacillus cereus πάνω στην οποία εκπονήθηκε η παρούσα μεταπτυχιακή διπλωματική διατριβή, και η οποία εμφανίζει 94% ομολογία με τη BA2944 του Bacillus anthracis και φέρει τα συντηρημένα χαρακτηριστικά που αναφέρθηκαν, αλλά αντί για Pro φέρει Ser στο ενεργό κέντρο. Η BC2929 (χωρίς το σηματοδοτικό πεπτίδιο) μελετήθηκε με διάφορες φυσικοχημικές μεθόδους με στόχο τη διερεύνηση των ιδιοτήτων και ειδικά το σχηματισμό ολιγομερισμού και τη δημιουργία συσσωματωμάτων. Υπερεκφράστηκε σε κύτταρα BL21 DE3 (παρουσία πρωτεϊνών οδηγών-των τσαπερονών) καθώς και σε κύτταρα JM109 (χωρίς τσαπερόνες) όπου παρατηρήθηκε παρόμοιο επίπεδο μέτριας διαλυτότητας, ενώ η πρωτεΐνη ήταν ιδιαίτερα ασταθής. Οι κρυσταλλώσεις που
7
δοκιμάστηκαν, δεν έδωσαν αποτέλεσμα. Μετά από χρωματογραφία μοριακής διήθησης (gel filtration) διαπιστώθηκε η παρουσία διαφορετικών πληθυσμών, με το δεύτερο από τα peaks που εμφανίστηκαν να παρουσιάζει ενεργότητα απακετυλάσης. Επίσης, κατά τη συμπύκνωση της πρωτεΐνης εμφανίζονταν συσσωματώματα, τα οποία παρατηρήθηκαν με μικροσκοπία TEM. Η αποκοπή (truncation) του C-τελικού άκρου της BC2929 φαίνεται να μείωσε ακόμα περισσότερο τη διαλυτότητα και σταθερότητά της και να επηρέασε το σχηματισμό των συσσωματωμάτων ενώ η αποκοπή του Ν-τελικού άκρου επηρεάζει τον πολυμερισμό. H ομόλογή της ΒΑ2944 βρέθηκε ότι εκκρίνεται στην επιφάνεια του κυττάρου, δρώντας στον ουδέτερο πολυσακχαρίτη, ενώ και η ίδια η BC2929 προβλέπεται, βάσει προγράμματος, να είναι περιπλασμική. Έτσι, υπάρχει μια υποψία ότι μπορεί να εμπλέκεται ενδεχομένως στη δημιουργία των βιοϋμενίων του Bacillus cereus.Τα αποτελέσματα λοιπόν έδειξαν ότι πρόκειται για μια ασταθή πρωτεΐνη που περνάει διάφορες καταστάσεις ολιγομερισμού ενώ απαιτούνται δομικές μελέτες και επιπλέον πειράματα, για διαλευκανθεί η λειτουργία της.
|
Δομικός και βιοχημικός χαρακτηρισμός της απακετυλάσης πολυσακχαριτών BC2929, του Bacillus cereus
