| Περίληψη |
Ο κυτταροσκελετός της ακτίνης αποτελεί έναν κεντρικό κρίκο στην αλυσίδα ανίχνευσης και μετάδοσης κυτταρικών μηνυμάτων. Η ταχεία μεταβολή της κατάστασης πολυμερισμού του κυτταροσκελετού της ακτίνης κατά αυστηρά ρυθμιζόμενο και ελεγχόμενο τρόπο, τον καθιστά ένα γρήγορο και ευαίσθητο ανταποκρινόμενο αισθητήριο όργανο, το οποίο ελέγχει πλήθος κυτταρικών λειτουργιών όπως είναι η κίνηση του κυττάρου, η διατήρηση του όγκου, του σχήματος και της πολικότητας του, η πρόσφυση στην εξωκυττάρια ουσία και η ανάπτυξη δύναμης σύσπασης ή κινητήριας δύναμης. Ο παράγοντας TGF-β1 ανήκει σε μια υπερ-οικογένεια εκκρινόμενων κυτοκινών, οι οποίες επηρεάζουν πλήθος κυτταρικών διεργασιών και αποκρίσεων όπως ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων, η διαφοροποίηση, η μετανάστευση και η απόπτωση. Η βασική μηχανή μεταγωγής μηνύματος του TGF-β1 ενεργοποιείται όταν ο παράγοντας συνδέεται με δύο μεμβρανικούς υποδοχείς τύπου Ι και ΙΙ με δράση κινάσης σερίνης- θρεονίνης. Τότε το σύμπλοκο των υποδοχέων ενεργοποιείται και μέσω των Smad πρωτεϊνών επάγεται η έκφραση πλήθους γονιδίων. Εκτός όμως από τη βασική σηματοδοτική μηχανή του TGF-β, πλήθος άλλων πρωτεϊνών έχουν ταυτοποιηθεί να δρουν καθοδικά από τους υποδοχείς του, η ύπαρξη των οποίων εγείρει πλήθος σημαντικών ερωτημάτων με κυριότερο το αν είναι πράγματι ανεξάρτητα του μονοπατιού των Smad πρωτεϊνών. H αναδιοργάνωση του κυτταροσκελετού της ακτίνης σε απόκριση αυξητικών παραγόντων, όπως είναι ο παράγοντας TGF-β, ελέγχει την πρόσφυση των κυττάρων, την κίνηση και την ανάπτυξη σε διάφορους κυτταρικούς τύπους. Στην παρούσα διδακτορική διατριβή μελετήθηκε η κυτταροσκελετική απόκριση ινοβλαστών στον TGF-β. Ακολούθησε διερεύνηση και ταυτοποίηση των πρωτεϊνικών μορίων μου μεσολαβούν για την μετάδοση του μηνύματος από τον παράγοντα προς τον κυτταροσκελετό της ακτίνης. Ο παράγοντας TGF-β1 επάγει άμεσα έντονη αναδιοργάνωση του κυτταροσκελετού της ακτίνης σε Swiss3T3 και εμβρυονικούς ινοβλάστες ποντικού (MEFs), η οποία είναι εμφανής πολύ νωρίς. Στους Swiss3T3 ινοβλάστες, ο παράγοντας TGF-β1 ενεργοποιεί δύο μέλη των Rho GTPασών, τη RhoA και τη RhoB. Η ενεργοποίηση και των δύο πρωτεϊνών αποδείχθηκε απαραίτητη για την επαγώμενη από τον TGF-β1 αναδιοργάνωση του κυτταροσκελετού της ακτίνης, αφού υπερέκφραση της μονίμου ανενεργής μορφής είτε της RhoA είτε της RhoB παρεμποδίζει τον πολυμερισμό της ακτίνης. Οι LIM κινάσες είναι γνωστό ότι ενεργοποιούνται καθοδικά των Rho GTPασών, ως εκ τούτου ελέγχθηκε η συμμετοχή τους στο μονοπάτι. Ο TGF-β1 επάγει άμεσα την ενεργοποίηση της LIMK2, η οποία συνοδεύεται από αυξημένη φωσφορυλίωση της ενδογενούς κοφιλίνης που συγκατακρημνίζεται μαζί της. Παράλληλα, η ενεργοποίηση των κυττάρων από τον TGF-β1 έχει σαν αποτέλεσμα την αύξηση του συνεντοπισμού της LIMK2 με ινιδιακές δομές. Επιπλέον, η γονιδιακή αποσιώπηση της LIMK2 με τη χρήση μικρών κατασταλτικών RNA (siRNA), ανέστειλε δραματικά τον επαγώμενο από τον TGF-β1 πολυμερισμό της ακτίνης. Η LIMK1 δεν συμμετέχει στο σηματοδοτικό μονοπάτι αναδιοργάνωσης του κυτταροσκελετού της ακτίνης από τον TGF-β1, αφού δεν παρατηρήθηκε αύξηση της φωσφορυλίωσης της πρωτεΐνης ούτε και μεταβολή του κυτταροπλασματικού της εντοπισμού μετά από ενεργοποίηση των κυττάρων με τον παράγοντα. Η πρωτεΐνη που συνδέει λειτουργικά τις Rho GTPάσες με τη LIMK2 είναι η πρωτεϊνική κινάση ROCK1, αφού επώαση των κυττάρων με έναν εξειδικευμένο αναστολέα της παρεμποδίζει τόσο την επαγώμενη από τον TGF-β1 αναδιοργάνωση του κυτταροσκελετού της ακτίνης, όσο και την ενεργοποίηση της LIMK2 και την φωσφορυλίωση της κοφιλίνης. Παράλληλα πειράματα δοκιμής επούλωσης πληγής έδειξαν ότι η αναδιοργάνωση του κυτταροσκελετού της ακτίνης από τον TGF-β1 στους Swiss3T3 ινοβλάστες συνοδεύεται και από αυξημένη κινητικότητα των κυττάρων. Αναστολή του μονοπατιού με τον αναστολέα της ROCK1 (Y27632) παρεμβαίνει στην επαγώμενη αυξημένη κινητικότητα των Swiss3T3 ινοβλαστών από τον TGF-β. O ρόλος του τύπου Ι υποδοχέα του TGF-β (ΤβRI) αποδείχθηκε όταν υπερεκφράστηκε στους Swiss3T3 ινοβλάστες μια μεταλλαγμένη μορφή του ΤβRI (caALK-5), που τον καθιστά μονίμως ενεργό ως προς τη δράση κινάσης. Tα κύτταρα στα οποία εκφράστηκε ο caALK-5 εμφάνησαν έντονη αναδιοργάνωση του κυτταροσκελετού της ακτίνης και ενεργοποίηση της RhoA, απουσία ενεργοποίησης των κυττάρων με τον παράγοντα TGF-β1. Αντίθετα, υπερέκφραση του caALK-5mL45, ο οποίος εκτός από τη μετάλλαξη που τον καθιστά μονίμως ενεργό έχει μια επιπλέον μετάλλαξη που καθιστά αδύνατη την πρόσδεση και ενεργοποίηση των Smad πρωτεϊνών, ήταν αναποτελεσματική ώς προς την ενεργοποίηση τόσο της κυτταροσκελετικής απόκρισης των κυττάρων, όσο και της ενεργοποίησης της RhoA. Σε συμφωνία με αυτά τα αποτελέσματα, υπερέκφαση της Smad7 σε Swiss3T3 ινοβλάστες παρεμποδίζει την ικανότητα του TGF-β1 να επάγει πολυμερισμό της ακτίνης, ενώ παράλληλα παρεμποδίζει την ενεργοποίηση της RhoA. Επιπλέον, η υπερέκφραση είτε της Smad2 είτε της Smad3 οδηγεί σε έντονο πολυμερισμό της ακτίνης και ενεργοποίηση της RhoA απουσία του παράγοντα. Ενεργοποίηση των κυττάρων με TGF-β1 οδηγεί σε αυξημένα επίπεδα α-SMA στα κύτταρα, η οποία εντοπίζεται κυρίως στο αδιάλυτο κυτταροσκελετικό κλάσμα. Αναστολή της πρωτεΐνης ROCK1, με τον εξειδικευμένο αναστολέα της Υ27632, δεν παρεμποδίζει την αυξημένη έκφραση της α-SMA. Υπερέκφραση της Smad3 (και σε μικρότερο βαθμό της Smad2) οδήγηγησε σε αύξηση της έκφρασης της α-SMA απουσία ενεργοποίησης με TGF-β1. Συμπερασματικά, στην παρούσα διατριβή ταυτοποιήθηκε για πρώτη φορά, ένα νέο μη-γενωμικό μονοπάτι που σηματοδοτεί την άμεση απόκριση των κυττάρων στον TGF-β. Το μονοπάτι αυτό ξεκινά από τον τύπου Ι υποδοχέα του TGF-β και μέσω των Rho GTPασών RhoA και RhoB, ROCK1, LIMK2 και κοφιλίνης καταλήγει στον πολυμερισμό της ακτίνης. Καταδεικνύεται για πρώτη φορά η ύπαρξη δομικών στοιχείων στον τύπου Ι υποδοχέα τα οποία είναι υπεύθυνα για την κυτταροσκελετική απόκριση, καθώς και η συμμετοχή της α-λείας μυϊκής ακτίνης στην μακροπρόθεσμη απόκριση του κυτταροσκελετού της ακτίνης στον TGF-β. Τέλος, παρουσιάζονται πειραματικά δεδομένα που δείχνουν την πιθανή ύπαρξη επικοινωνίας του μονοπατιού των Rho GTPασών με τις Smad πρωτεΐνες μια και η έκφραση των Smad2 και Smad3 επηρεάζει την ενεργοποίηση του.
|
Ταυτοποίηση ενός νέου σηματοδοτικού μονοπατιού που ελέγχει την αναδιοργάνωση του κυτταροσκελετού της ακτίνης από τον Μετασχηματίζοντα Αυξητικό Παράγοντα--β1 (TGF--β1)
