| Περίληψη |
H εγγενής ανοσία είναι απαραίτητη στην αποτελεσματική άμυνα έναντι ενδογενών και εξωγενών παραγόντων. Ωστόσο η υπερβολική ενεργοποίησή της μπορεί να οδηγήσει σε ανεπιθύμητες αντιδράσεις του οργανισμού, όπως αυτοανοσία και μη αναστρέψιμη ιστική καταστροφή . Γι’ αυτό το λόγο οι διαμεσολαβητές της εγγενούς ανοσίας, όπως τα μονοκύτταρα/μακροφάγα, έχουν αναπτύξει ένα πολύπλοκο σύστημα αυτορρύθμισης που ουσιαστικά παράγει έναν αντιφλεγμονώδη φαινότυπο που χαρακτηρίζεται από ανοσολογική ανοχή. Η πλειορρύθμιση μορίων που αναστέλλουν τη σηματοδότηση κάτωθεν του TLR4 υποδοχέα, του οποίου ο προσδέτης είναι ο LPS, είναι ένας από τους μηχανισμούς που διαμεσολαβούν το παραπάνω φαινόμενο.
Ο ΙRAK-M ταυτοποιήθηκε το 1999 ως μέλος της οικογένειας irak των κινασών σερίνης/θρεονίνης, οι οποίες διευκολύνουν τη μετάδοση του σήματος κάτωθεν πολλών TLRs και της IL-1β. Ενώ αρχικά εθεωρείτο ότι ο IRAK-M επιτελεί όμοιες λειτουργίες με τις λοιπές κινάσες της οικογένειας, δείχθηκε αργότερα ότι ουσιαστικά αποτελεί ανενεργό μέλος, στερούμενο μιας λειτουργικής δομικής περιοχής κινάσης. Επιπλέον, θεωρείται από το 2002 ως ένας από τους πιο σημαντικούς αρνητικούς ρυθμιστές του σηματοδοτικού μονοπατιού των TLRs: πρωτογενή μακροφάγα μυών στα οποία έχει απαλειφθεί ο IRAK-M δεν εμφανίζουν ανοχή μετά από παρατεταμένη διέγερση με LPS. Επίσης, τα ίδια κύτταρα μετά από επώαση με αγωνιστές των TLR υποδοχέων εμφανίζουν αυξημένη έκφραση προφλεγμονωδών κυτταροκινών και υπερενεργοποίηση μεσολαβητών κάτωθεν του σηματοδοτικού συμπλέγματος των ΤLR. Σε πιο πρόσφατες δημοσιεύσεις ο IRAK-M βρίσκεται σταθερά πλειορρυθμισμένος υπό συνθήκες ανοχής, διαδικασία η οποία εξαρτάται από το χρόνο επώασης και την ένταση του σήματος: υψηλότερα επίπεδα mRNA του IRAK-M λαμβάνονται με μεγαλύτερες συγκεντρώσεις των προσδετών των TLR και με μεγαλύτερες περιόδους επώασης, εντός ορισμένων ορίων. Τέλος, ο ρόλος του IRAK-M στη ρύθμιση της ενεργοποίησης της εγγενούς ανοσίας τεκμηριώνεται με πλήθος επιδημιολογικών και κλινικών δεδομένων.
Παρά τη σχετικά καλή κατανόηση του μηχανισμού λειτουργίας του ΙRAK-M, λίγα είναι γνωστά για τη μεταγραφική ρύθμιση του γονιδίου του. Σε πολλές δημοσιεύσεις έχει καταδειχθεί η πλειορρύθμιση του IRAK-M κατόπιν διέγερσης με πλειάδα TLR αγωνιστών, ωστόσο είναι σπάνιες και ελλιπείς οι πληροφορίες που αφορούν στους μεταγραφικούς παράγοντες και στα σηματοδοτικά μονοπάτια που ευθύνονται για την έκφρασή του. Στη διαδικασία αυτή έχουν εμπλακεί ο υποδοχέας των γλυκοκορτικοστεροειδών, ο PU.1 και ο SMAD 4, αλλά μόνο εμμέσως. Επίσης, η αντιπονεκτίνη φαίνεται να ρυθμίζει την έκφραση του IRAK-M μέσω των PI3K/akt και tpl2/ERK μονοπατιών. Ιδιαίτερο ενδιαφέρον έχουν πρόσφατες δημοσιεύσεις που αποκαλύπτουν επιπλέον παραμέτρους στη ρύθμιση του IRAK-M: την κυτταρική διαμερισματοποίηση και την ενδοκυττάρια διακίνηση (trafficking).
Στόχος της παρούσας έρευνας είναι η διευκρίνιση των μηχανισμών που διαμεσολαβούν την έκφραση του IRAK-M σε μεταγραφικό επίπεδο. Η ταυτοποίηση των κύριων μεταγραφικών παραγόντων και η κατανόηση των μηχανισμών ρύθμισής τους στο πλαίσιο φλεγμονής και ανοσολογικής ανοχής αποτελούν τους κύριους στόχους των πειραμάτων. Αξίζει να
σημειωθεί ότι η έρευνα αυτή αποτελεί συνέχεια των προσπαθειών του εργαστηρίου να ταυτοποιηθούν οι μηχανισμοί επαγωγής ανοχής από το PI3K/akt μονοπάτι σε κύτταρα της εγγενούς ανοσίας.
Με αξιοποίηση των διαθέσιμων στο διαδίκτυο δεδομένων φάνηκε ότι η θέση έναρξης της μεταγραφής του IRAK-M πρέπει να εντοπίζεται σε μια περιοχή περίπου 90 εως 100 ζεύγη βάσεων άνωθεν της θέσης έναρξης της μετάφρασης (1ο
Μετά από λεπτομερή εξέταση μη κωδικών αλληλουχιών βρέθηκε ότι ο LPS επάγει τη έκφραση του IRAK-M μέσω μιας θέσης πρόσδεσης του NF-κΒ η οποία εντοπίζεται 339 ζεύγη βάσεων άνωθεν της θέσης έναρξης της μετάφρασης. Ο NF-κΒ, που αποτελεί κύριο ρυθμιστή της ενδοκυττάριας σηματοδότησης του LPS, προσδένεται άμεσα σε αυτή τη θέση μετά από σύντομη διέγερση με LPS σε λευχαιμικά μακροφάγα μυών RAW 264.7 και ενεργοποιεί το γονίδιο του IRAK-M. Βρέθηκε επίσης ότι οι IFN-a και IL-10 δεν μπορούν να πλειορρυθμίσουν τον IRAK-M, εύρημα που μας επιτρέπει να θεωρούμε ότι έχουν ενδεχομένως κατασταλτική επίδραση μέσω άμεσου ανταγωνισμού μεταξύ NF-κΒ-STAT για πρόσδεση στον υποκινητή του IRAK-M. εξώνιο), κάτι που συσχετίζεται και με παρατηρήσεις ομολογίας μεταξύ των ειδών. Επιπλέον, η in silico ανάλυση μη κωδικών αλληλουχιών άνωθεν του IRAK-M γονιδίου αποκάλυψε ότι πρόκειται για ένα γονίδιο χωρίς TATA αλληλουχία και ότι υπάρχει σημαντική συσσώρευση θέσεων πρόσδεσης σχετικών μεταγραφικών παραγόντων εγγύς της πιθανής περιοχής έναρξης της μεταγραφής.
Παρέχουμε επίσης επιπλέον αποδείξεις ότι η σηματοδότηση του PI3K/akt εμπλέκεται στη μεταγραφή του IRAK-M, καταδεικνύοντας αλληλεπίδραση με τον C/EBPβ, έναν σημαντικό μεταγραφικό παράγοντα του οποίου η έκφραση επάγεται με φλεγμονώδη ερεθίσματα. Το LPS επάγει την πρόσδεση του C/EBPβ στον υποκινητή του IRAK-M στα μακροφάγα μυών RAW 264.7. Η εν λόγω αλληλεπίδραση εξαρτάται κυρίως από το μονοπάτι PI3K/akt, καθώς θεραπεία με wortmannin-αναστολέας της PI3K-αποτρέπει αυτή την πρόσδεση.
Συμπερασματικά, τα παραπάνω δεδομένα υποδεικνύουν τη λειτουργία ενός παλιού και βασικού θέματος στην Ανοσοβιολογία : τα σηματοδοτικά μονοπάτια ουσιαστικά καθοδηγούν και την απενεργοποίησή τους. Στην παρούσα έρευνα καταδεικνύουμε ότι η σηματοδότηση μέσω του TLR4 επάγει η ίδια την καταστολή του. Αυτό το καταφέρνει χρησιμοποιώντας τους ίδιους μεταγραφικούς παράγοντες που προάγουν τις προφλεγμονώδεις του δράσεις.
|
Transcripional regulation of murine IRAK-M.
