| Περίληψη |
Στη διατριβή αυτή παρουσιάζεται μια πειραματική διαδικασία που χρησιμοποιεί τα επιδεκτικά-γενετικού μετασχηματισμού μεριστωματικά κύτταρα του κορυφαίου μεριστώματος in vitro νεαρών φυτών και των εμβρυακών αξόνων ώριμων σπερμάτων βαμβακιού με σκοπό την αναγέννηση φυτών Ελληνικών ποικιλιών χωρίς την μεσολάβηση φάσης κάλλου. Επαγωγή βλαστογένεσης επιτεύχθηκε σε MS-θρεπτικό υπόστρωμα με 0,1 mg/l Kινετίνη (Kin) για τα κορυφαία μεριστώματα και με 3 mg/l BAP για τους εμβρυακούς άξονες. Για την «φυσιολογική» (χωρίς παραμορφώσεις ή ανωμαλίες) επιμήκυνση των εκπτυσσόμενων βλαστών σε τελικό μέγεθος 5-10 cm προτείνεται η χρήση μέσου ίδιας σύστασης (MS) με χαμηλότερη συγκέντρωση Kin (0,01 mg/l). Η ριζογένεση των νέων βλαστών επιτεύχθηκε με καλλιέργειά τους σε 0,5 MS με 0.3 % Ενεργοποιημένο Ανθρακα (AC) για τα κορυφαία μεριστώματα και σε Mc.Stewart and Hsu θρεπτικό με 0,01 mg/l NAA για τους εμβρυακούς άξονες. Αναγεννημένα φυτά βαμβακιού προκύπτουν εντός 6-10 εβδομάδων απο την απομόνωση των εκφύτων και την έναρξη της καλλιέργειας, ανάλογα με την ποικιλία. Η περιγραφόμενη πειραματική διαδικασία εφαρμόστηκε με επιτυχία σε τέσσερις διαφορετικές Ελληνικές ποικιλίες βαμβακιού (M1, M2, M3, ΦΩΤΕΙΝΗ) με ποσοστό αναγέννησης ολόκληρων φυτών 5-10 %. Για την πολλαπλή βλαστογένεση (στόχοι για γενετικό μετασχηματισμό) σε προγράμματα μικροπολλαπλασιασμού για το βαμβάκι, προτείνεται η αποκλειστική χρησιμοποίηση της κυτοκινίνης TDZ σε συγκεντρώσεις 0,022-2,2 mg/l. Σε προκαταρκτικά πειράματα με τις τέσσερις ποικιλίες βαμβακιού δεν παρατηρήθηκαν πολλαπλοί βλαστοί ανά έκφυτο μετά απο 2 εβδομάδες καλλιέργειας. Επίσης παρουσιάζονται προκαταρκτικά πειράματα για την ευαισθησία σε διάφορες συγκεντρώσεις καναμυκίνης που επιδεικνύουν οι τύποι ιστών (κορυφαία μεριστώματα, εμβρυακοί άξονες) που θα χρησιμοποιηθούν ως έκφυτα για τον γενετικό μετασχηματισμό ώστε να καθοριστεί η χαμηλότερη συγκέντρωσή της για την επιλογή μετασχηματιμένων φυτών. Ακόμα παρουσιάζονται μέθοδοι μοριακής ανάλυσης (απομόνωση γενωμικού DNA, αλυσιδωτή αντίδραση της πολυμεράσης για την ταυτοποίηση γονιδίων, ιστοχημικός εντοπισμός της β-γλυκουρονιδάσης ) όπως βελτιστοποιήθηκαν για ιστούς βαμβακιού με σκοπό να χρησιμοποιηθούν για την ανίχνευση και τον εντοπισμό πιθανών μετασχηματισμένων φυτών βαμβακιού. Τέλος, εξετάστηκε η δυνατότητα ανάπτυξης συστήματος παροδικής έκφρασης με τη μέθοδο της «αγροέγχυσης». Χρησιμοποιήθηκαν γονιδιακές κασσέτες επαγόμενης και συστατικής έκφρασης γονίδιων αμολυσματικότητας (avr γονιδίων) του φυτοπαθογόνου Pseudomonas syringae pv. phaseolicola σε ποικιλίες βαμβακιού (φυτά μη-ξενιστές). Σκοπός των πειραμάτων αυτών ήταν μεταξύ άλλων και ο προσδιορισμός ανθεκτικών φυτών που θα έφεραν γονίδια ανθεκτικότητας (r γονίδια) λειτουργικά αντίστοιχα με το γονίδιο αμολυσματικότητας του φυτοπαθογόνου με το οποίο γινόταν η δοκιμή (gene-for-gene hypothesis).
|
Χρησιμοποίηση εμβρυακών αξόνων και μεριστωμάτων βαμβακιού (Gossypium hirsutum L.) για αναγέννηση γενετικά τροποποιημένων φυτών και ανάπτυξη μεθόδου παροδικής γονιδιακής έκφρασης.
