| Περίληψη |
Το ανοσοποιητικό σύστημα έχει αναπτύξει μηχανισμούς για την αντιμετώπιση των παθογόνων μικροοργανισμών. Παράλληλα με αυτούς αναπτύχθηκαν και ομοιοστατικοί μηχανισμοί που επαναφέρουν το σύστημα κοντά στην αρχική του κατάσταση και επιπλέον μηχανισμοί αποτρέπουν την ανοσοαπάντηση εναντίον συστατικών του εαυτού. Η δεύτερη αυτή ομάδα μηχανισμών ονομάζεται συνολικά ανοσολογική ανοχή. Η ανοχή των Τ λεμφοκυττάρων μπορεί να εγκαθιδρυθεί είτε στο θύμο (κεντρική ανοχή) ή/και στα περιφερικά λεμφοειδή όργανα (περιφερική ανοχή). Για να μελετήσουμε την περιφερική ανοχή των CD8 Τ λεμφοκυττάρων χρησιμοποιήσαμε ποντίκια διαγονιδιακά για την πρωτεΐνη ΝΡ του ιού της γρίπης. Επίσης χρησιμοποιήσαμε ποντίκια διαγονιδιακά για έναν συγκεκριμένο Τ υποδοχέα, τον F5, που αναγνωρίζει έναν επίτοπο της πρωτεΐνης ΝΡ παρουσιαζόμενο από το τάξης Ι ΜΗC μόριο Db. Επίσης χρησιμοποιήθηκαν διπλά διαγονιδιακά ποντίκια F5/ΝΡ. Στα F5/ΝΡ ποντίκια δεν παρατηρείται αυξημένη αρνητική επιλογή των F5 θυμοκυττάρων (κεντρική ανοχή). Αντίθετα υπάρχει έκδηλη κλωνική απαλοιφή των F5 CD8 Τ κυττάρων στα περιφερικά λεμφοειδή όργανα των F5/ΝΡ ποντικιών. Επιπλέον τα εναπομείναντα CD8 Τ κύτταρα είναι άνεργα μιας και δεν πολλαπλασιάζονται σε δεύτερη διέγερση στο ΝΡ αντιγόνο in vitro. Η υποδραστικότητα των F5/ΝΡ CD8 Τ λεμφοκυττάρων οφείλεται τουλάχιστον εν μέρει στην ανικανότητά τους να αυξήσουν τα επίπεδα του υποδοχέα της ΙL-2 ώστε να μη μπορούν να αξιοποιήσουν επαρκώς την IL-2, κάτι που πιθανώς εξηγεί την μερική μόνο αναστροφή του άνεργου φαινοτύπου μετά την προσθήκη εξωγενούς ΙL-2. Επιβεβαιωτικό του ότι η ανέργεια των F5 Τ λεμφοκυττάρων επάγεται πράγματι στην περιφέρεια είναι πως περιφερικά παρθένα F5 κύτταρα που μεταφέρονται σε ΝΡ αποδέκτες καθίστανται άνεργα μετά από κάποια χρονική περίοδο. Στα παραπάνω μοντέλα δείξαμε ότι πριν την επαγωγή ανέργειας έχει προηγηθεί ενεργοποίηση των F5 CD8 Τ κυττάρων όπως υποδηλώνουν οι αυξημένοι μάρτυρες ενεργοποίησης αλλά και η κλωνική επέκταση των F5 Τ κυττάρων στα πειράματα μεταφοράς. Έτσι, η επαγωγή ανέργειας στα παραπάνω μοντέλα προέρχεται κυρίως από παρατεταμένη έκθεση στο αντιγόνο που παρουσιάζεται από κύτταρα αντιγονοπαρουσιαστές (APCs) και όχι από έλλειψη συνδιέγερσης. Προσπαθήσαμε να ταυτοποιήσουμε νέα γονίδια που να εμπλέκονται στην εγκαθίδρυσηή/και στην επαγωγή της ανέργειας στα F5/ΝΡ CD8 Τ κύτταρα. Για το λόγο αυτό χρησιμοποιήσαμε την τεχνολογία του mRNA Differential Display σε RNAs από παρθένα F5 CD8 Τ κύτταρα και άνεργα F5/ΝΡ CD8 Τ κύτταρα. Μετά από μια σχετικά εκτεταμένη αναζήτηση βρήκαμε ότι ένα μετάγραφο που αντιστοιχεί στο γονίδιο SLP-65 εκφράζεται σε πολύ μεγαλύτερο βαθμό στα άνεργα F5/ΝΡ CD8 Τ κύτταρα σε σχέση με τα παρθένα F5. Περαιτέρω, θελήσαμε να μελετήσουμε το ρόλο των πρωτεϊνών TNF και Fas της TNF/ΤΝFR υπεροικογένειας στο προσαρμόσιμο ανοσοποιητικό σύστημα και συγκεκριμένα στα CD8 Τ κύτταρα. Έτσι χρησιμοποιώντας τα παραπάνω συστήματα διαγονιδιακών ποντικιών σε συνδυασμό με ποντίκια με ανενεργό το tnf ή fas γονίδιο μελετήσαμε την επίδραση του TNF και του Fas στις κλωνοτυπκές αποκρίσεις των CD8 Τ κυττάρων σε αντιγόνα αλλά και τη συνεισφορά τους στην επιβίωση και εν γένει στην ομοιόσταση των CD8 Τ κυττάρων. Συγκεκριμένα, δείξαμε ότι η ανυπαρξία ενδογενούς TNF έχει σαν αποτέλεσμα μειωμένους αριθμούς περιφερικών F5 κυττάρων καθώς και ελαττωμένη ικανότητα τους για ομοιοστατικό πολλαπλασιασμό μετά από μεταφορά τους σε λεμφοπενικούς αποδέκτες. Μάλιστα αυτή η ικανότητα επηρεάζεται από την ικανότητα έκφρασης TNF από τα Τ λεμφοκύτταρα και όχι από τον αποδέκτη. Επιπλέον, δείξαμε ότι τα F5/TNF-/- CD8 Τ κύτταρα αποκρίνονται σε μικρότερο βαθμό στο αντιγόνο τόσο in vitro όσο και in vivo σε σχέση με F5, δηλαδή διαιρούνται με μικρότερο ρυθμό και εκφράζουν σε χαμηλότερο βαθμό χαρακτηριστικούς επιφανειακούς μάρτυρες ενεργοποίησης. Αυτή η μειωμένη ενεργοποίηση των F5/TNF-/- Τ κυττάρων συνοδεύεται και από μειωμένο αποπτωτικό θάνατο που επάγεται από την ενεργοποίηση τους (AICD). Η επίδραση της TNF μεταλλαγής δεν περιορίζεται στον F5 κλώνο καθώς και TNF-/- Τ κύτταρα έχουν μειωμένη ικανότητα πολλαπλασιασμού και αποπτωτικού θανάτου όταν διεγερθούν πολυκλωνικώς με a-CD3. Οι ελαττωματικές αποκρίσεις των TNF-/- Τ κυττάρων μετά από διέγερση του TCR συνδέονται με τη μειωμένη ενεργοποίηση των μεταγραφικών παραγόντων ΝF-κB και ΝF-AΤp που ανιχνεύσαμε σε F5/TNF-/- κύτταρα. Τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι ο TNF έχει έναν σημαντικό ρόλο στην περιφερική ανοχή των CD8 Τ λεμφοκυττάρων. Ειδικότερα, παρουσιάζεται μειωμένη κλωνική απαλοιφή των εν δυνάμει αυτοδραστικών F5/ΝΡ Τ κυττάρων στο TNF-/- υπόβαθρο. Επιπλέον τα F5/ΝΡ/TNF-/- CD8+ Τ κύτταρα έχουν σημαντικά αυξημένη δραστικότητα σε επαναδιέγερσή τους με αντιγόνο in vitro σε σχέση με τα ομόλογά τους από F5/ΝΡ ζώα. Επιβεβαιωτικά, σε πειράματα μεταφοράς παρθένων F5 κυττάρων σε ΝΡ αποδέκτες παρουσία ή απουσία TNF, η επαγωγή ανέργειας ήταν λιγότερο αποτελεσματική στη δεύτερη περίπτωση. Συνολικά λοιπόν τα πειραματικά μας δεδομένα δείχνουν ότι ο ενδογενής TNF μπορεί να διαμορφώνει μια πλειάδα λειτουργιών των CD8 Τ κυττάρων και αυτό οφείλεται στο ότι ενισχύει την TCR σηματοδότηση τόσο για συνδέτες χαμηλής όσο και για συνδέτες υψηλής συγγένειας. Τα πειράματά μας με lpr ποντίκια (μεταλλαγή που καθιστά ανενεργό το γονίδιο fas) έδειξαν ότι ο Fas έχει έναν ρόλο, αν και μικρό, στην συντήρηση του φυσιολογικού αριθμού περιφερικών F5 CD8 Τ κυττάρων σε νεαρά ποντίκια και μάλιστα η σύγχρονη έλλειψη TNF και Fas δρα προσθετικά στην μείωση των περιφερικών F5 CD8 Τ λεμφοκυττάρων. Η έλλειψη του Fas, δεν επηρεάζει τον αποπτωτικό θάνατο που επάγεται από ενεργοποίηση στα F5 Τ κύτταρα in vivo όπως έδειξαν πειράματα μεταφοράς λεμφοκυττάρων σε ΝΡ αποδέκτες. Μάλιστα δεν γίνεται ορατός κάποιος ρόλος του Fas στον θάνατο αυτό ακόμα και όταν ελλείπει συγχρόνως και ο TNF. Επίσης, ο ενδογενής Fas δεν έχει κάποιο εμφανή ρόλο στην κλωνική απαλοιφή των F5/ΝΡ CD8 Τ κυττάρων αλλά ούτε και στον άνεργο φαινότυπο των εναπομείναντων κυττάρων.
|
Ομοιοστατικοί μηχανισμοί κυτταροτοξικών Τ λεμφοκυττάρων σε μοντέλα διαγονιδιακών και ελλειμματικών ποντικιών
