| Περίληψη |
Το εκκριτικό σύστημα τύπου ΙΙΙ (Τ3SS, type three secretion system) είναι ένα δομικά και λειτουργικά συντηρημένο υπερμοριακό σύμπλοκο δομούμενο από περισσότερες από 20 διαφορετικές πρωτεΐνες που κωδικοποιούνται από συντηρημένες γονιδιακές «νησίδες» οι οποίες απαντώνται σε πολλά αρνητικά κατά Gram βακτήρια, κατά κανόνα είτε συμβιωτικά είτε παθογόνα ευκαρυωτικών οργανισμών. Εννέα από τις πρωτεΐνες του Τ3SS έχουν σημαντικό βαθμό ομολογίας, σε επίπεδο πρωτοταγούς αλληλουχίας, με πρωτεΐνες που δομούν στοιχεία του βασικού σωματίου του βακτηριακού μαστιγίου, με το οποίο το Τ3SS έχει κοινές εξελικτικές ρίζες.
Στην παρούσα διατριβή μελετήθηκε το δίκτυο αλληλεπιδράσεων μεταξύ πρωτεϊνών που δομούν το T3SS του φυτοπαθογόνου βακτηρίου Pseudomonas syringae pv. phaseolicola, αξιοποιώντας κυρίως ένα δικιστρονικό πλασμιδιακό φορέα, τον pPROPET ο οποίος κατασκευάστηκε στην πορεία της διατριβής, για την ετερόλογη συνέκφραση πρωτεϊνών στην Escherichia coli και συγκαθαρισμό συμπλόκων μεταξύ επιλεγμένων ζευγών πρωτεϊνών.
Για την πρωτεΐνη HrpG, η θέση του κωδικού της πλαισίου σε σχέση με της σεκρετίνης HrcC υπέδειξε ρόλο πιθανήs σαπερόνηs τάξης Ι. Περεταίρω ένδειξη ενός τέτοιου ρόλου προέκυψε από την κατάδειξη αλληλεπίδρασης της με τη ρυθμιστική του συστήματος πρωτεΐνη HrpJ μετά από συνέκφραση και συγκαθαρισμό σε ετερόλογο βακτηριακό σύστημα. Οι πρωτεΐνες HrpG-HrpV-HrpJ ανιχνεύτηκαν ως σύμπλοκο μετά από συνέκφραση από τρικιστρονική κασέτα στην E. coli. Οι θέσεις πρόσδεσης των HrpV και HrpJ επί της HrpG πιθανόν να είναι αλληλεπικαλυπτόμενες. Η αλληλεπίδραση HrpG-HrpJ συμπληρώνει τον ελλειπή κρίκο της αλυσίδας πρωτεϊνικών αλληλεπιδράσεων που εμπλέκονται στη μεταγραφική ρύθμιση του TTSS, στην οποία, σύμφωνα με προηγούμενες μελέτες, συμμετέχουν οι πρωτεΐνες HrpG, HrpV, HrpS, HrpR και ΗrpL που κωδικοποιούνται από τη νησίδα hrp/hrc. Πειράματα συνέκφρασης/συγκαθαρισμού έδειξαν ομοίως ότι η πρωτεΐνη HrpG αλληλεπιδρά ισχυρά με την καρβοξυτελική κυτταροπλασματική επικράτεια της μεμβρανικής πρωτεΐνης HrcU, συστατικού του κεντρικού πυρήνα του ενυοσώματος, και λιγότερο ισχυρά με την κυτταροπλασματική πρωτεΐνη HrpO. Οι αλληλεπιδράσεις της HrpG με μέλη του C-δακτυλίου υποστηρίζουν τον ρόλο σαπερόνης του T3SS για την πρωτεΐνη. Συμπληρωματικά, απομονώθηκε μετά από ετερόλογη έκφραση το σύμπλοκο HrcN-HrpE, ATPάσης του Τ3SS και αρνητικού ρυθμιστή της αντίστοιχα, αλλά μόνο σε ακραία αλκαλικό pH. Πειράματα μοριακής διήθησης κατέδειξαν την ύπαρξη δυο διαφορετικών μορφών του συμπλόκου HrcN-HrpE με διαφορετική μοριακή μάζα και πιθανή στοιχειομετρία.
Οι φυσικοχημικές ιδιότητες μιας σειράς επιλεγμένων διαλυτών πρωτεϊνών και πρωτεϊνικών συμπλόκων του T3SS της P. syringae pv. phaseolicola μελετήθηκαν σε τιμές pΗ 8 και 11 με μεθόδους μοριακής διήθησης, σκέδασης ακτίνων Χ σε μικρές γωνίες (SAXS) και κυκλικού διχρωισμού (CD): Οι πρωτεΐνες που μελετήθηκαν ήταν: α) η χαρπίνη HrpZ, β) η πρωτεΐνη HrpP, φερόμενη ως διακόπτης αλλαγής ειδίκευσης έκκρισης υποστρώματος κατ’ αναλογία με τις ανάλογές της πρωτεΐνες YscP στη Yersinia και FliK του μαστιγιακού TTSS, γ) η πρωτεΐνη HrpE (αρνητικός ρυθμιστής της ATPάσης του συστήματος HrcN) και η καρβοξυτελική της επικράτεια, ξεχωριστά και δ) το σύμπλοκο HrpG-HrpV, απομονωμένο μετά από υπερέκφραση από τον αντίστοιχο δικιστρονικό φορέα. Το ακραίο αλκαλικό pΗ: α) προώθησε την αποσυσσωμάτωση των μεγαλομοριακών φυσικών πληθυσμών των πρωτεϊνών, όπως εκτιμήθηκε από την υποχώρηση του εντοπιζόμενου στο νεκρό όγκο των στηλών
μοριακής διήθησης ποσοστού της κάθε πρωτεΐνης, β) οδήγησε στην εκτεταμένη διαμόρφωση των εκκρινόμενων πρωτεϊνών HrpZ, HrpP αφήνοντας άθικτα τα διμερή τους, γ) διέσπασε το πιθανό τετραμερές της πρωτεΐνης HrpE στην κατάσταση πιθανώς του διμερούς, δ) δεν διέσπασε το σύμπλοκο HrcN-HrpE, ε) οδήγησε σε μείωση των ποσοστών α-έλικας προς όφελος των ποσοστών β-κλώνων σε όλες τις περιπτώσεις αλλά σε καμία περίπτωση δεν επέφερε κατάρρευση της πρωτεϊνικής δευτεροταγούς δομής, στ) είχε μικρή ή καμία επίδραση στην τριτοταγή διαμόρφωση των υπό εξέταση μορίων, όπως έδειξαν μελέτες κυκλικού διχρωισμού στο εγγύς υπεριώδες ζ) κατά κανόνα οδήγησε σε μείωση της θερμοσταθερότητας των εξετασθέντων πρωτεϊνών, όπως αυτή εκφράζεται από την μείωση του σημείου μετάπτωσης (ΤΜ), και η) σε καμία περίπτωση δεν οδήγησε σε εμφάνιση ενδιάμεσων καταστάσεων κατά τη μετάβαση των μορίων από την αναδιπλωμένη στην αποδιπλωμένη μορφή.
|
Μοριακή αρχιτεκτονική των πρωτεινών του εκκριτικού συστήματος τύπου ΙΙΙ του βακτηρίου Pseudomonas syringae
