| Περίληψη |
Στόχο της παρούσας διατριβής αποτέλεσε η ανάπτυξη ενός συστήματος ειδικού
ανασυνδυασμού στο αρθρόποδο καρκινοειδές Parhyale hawaiensis με σκοπό την αξιοποίηση
της τεχνολογίας μετασχηματισμού και γονιδιακής παγίδευσης, για την διεξαγωγή
λειτουργικών συγκριτικών μελετών στα αρθρόποδα. Για το λόγο αυτό, επιλέχθηκε το
σύστημα του φάγου φC31, που έχει χρησιμοποιηθεί με επιτυχία στη δροσόφιλα και σε
ανθρώπινες κυτταρικές σειρές. Ο φάγος φC31 ενθέτει το γονιδίωμά του στο γένωμα του
ξενιστή με την χρήση ειδικού ανασυνδυασμού ανάμεσα στις περιοχές attB (βακτηριακό
σημείο πρόσδεσης) και attP (φαγικό σημείο πρόσδεσης). Την αναγνώριση των περιοχών
αυτών και την κατάλυση της αντίδρασης ανασυνδυασμού, αναλαμβάνει μια ιντεγκράση
που κωδικοποιείται από το γονιδίωμα του φάγου.
Αφού δημιουργήθηκαν διαγονιδιακά άτομα που φέρουν την περιοχή attP στο
γένωμα, ελέγχθηκε η δυνατότητα εισαγωγής με ειδικό ανασυνδυασμό ενός
θερμοεπαγώμενου γονιδίου μάρτυρα. Μετά την επιβεβαίωση του ειδικού ανασυνδυασμού,
επιχειρήθηκε η αντικατάσταση του γονιδίου μάρτυρα μιας γονιδιακής παγίδευσης. Η
υψηλή συχνότητα μετατροπής μιας παγίδευσης (distal) από DsRed σε eGFP, ανοίγει τον
δρόμο στην χρήση του συστήματος του φάγου φC31 στην αξιοποίηση των παγιδεύσεων
που θα προκύψουν από τη σάρωση του γονιδιώματος του Parhyale hawaiensis.
Επιπλέον, η ενσωμάτωση εργαλείων με αποδεδειγμένη ενεργότητα σε διαφορετικά
είδη (3xP3, φθορίζουσες πρωτεΐνες, ιντεγράση φC31, αλληλουχίες αποδοχής ματίσματος)
καθιστούν την τελική κατασκευή έναν πιθανά οικουμενικό φορέα, για την εύκολη
παγίδευση και κλωνοποίηση νέων γονιδίων και την διεξαγωγή λειτουργικών πειραμάτων σε
νέους οργανισμούς.
Στο δεύτερο μέρος της διατριβής, που έγινε σε συνεργασία με τον μεταδιδακτορικό
ερευνητή Δρ. Τάσο Παυλόπουλο του πανεπιστημίου του Κέημπρητζ, παρουσιάζεται ο ρόλος
του ομοιωτικού γονιδίου Ubx στην ανάπτυξη και εξέλιξη των άκρων στα καρκινοειδή. Η
ποικιλομορφία που παρατηρούμε σημερα στην μορφολογία των άκρων στα καρκινοειδή,
είναι προϊόν της εξέλιξής τους ώστε να ανταποκριθούν σε νέες ανάγκες και να καλύψουν
καλύτερα παλαιότερες. Οι γενετικοί μηχανισμοί με τους οποίους μπορεί να παραχθεί αυτή
η ποικιλομορφία ήταν μέχρι σήμερα άγνωστοι. Βασιζόμενοι στην συσχέτιση της απουσίας
του ομοιωτικού γονιδίου Ubx με την ανάπτυξη των maxillipeds, που αποτελούν θωρακικά
άκρα διαφοροποιημένα να επιτελούν λειτουργίες χειρισμού τροφής, οι Averof και Patel
πρότειναν το 1997 την υποχώριση της έκφρασης του Ubx από τα πρώτα θωρακικά
μεταμερίδια ως πιθανό μηχανισμό εμφάνισης αυτού του τύπου άκρου.
Εκμεταλλευόμενοι τα νέα εργαλεία μετασχηματισμού και θερμοεπαγώμενης
υπερέκφρασης, καθώς και την ευκολία γενετικού χειρισμού στο αμφίποδο Parhyale
hawaiensis, θελήσαμε να ελέγξουμε αυτή την υπόθεση προσφέροντας εκτοπικά Ubx στο
πρώτο θωρακικό μεταμερίδιο που αναπτύσσει maxillipeds. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν
πως το Ubx είναι ικανό να “επαναφέρει” στα maxillipeds τη μορφολογία θωρακικών άκρων,
ενώ συμπληρωματικά πειράματα καταστολής του Ubx (από το εργαστήριο του NH Patel)
υποδεικνύουν και την αναγκαιότητά του στον καθορισμό της “θωρακικής ταυτότητας”.
Για να εξηγήσουμε το αναπάντεχο αποτέλεσμα της εμφάνισης maxillipeds από την
εκτοπική έκφραση του Ubx σε κεφαλικά μεταμερίδια, μελετήσαμε την αλληλεπίδραση του
Ubx με ένα άλλο ομοιωτικό γονίδιο (Scr), και δείξαμε πως ο φαινότυπος των maxillipeds
μπορεί να προκύψει και με διαφορετικό μηχανισμό. Τέλος, ο μεγάλος αριθμός
μετασχηματισμών, μας έδωσε την δυνατότητα να περιγράψουμε ένα ευρή φάσμα
φαινοτύπων μετατροπής ενός κεφαλικού εξαρτήματος (maxilla) σε ένα βαδιστικό άκρο,
υποδεικνύοντας την ποικιλομορφία που μπορούν να προσφέρουν για φυσική επιλογή,
μικρές μόνο αλλαγές στην έκφραση ενός γονιδίου όπως το Ubx.
|
Ανάπτυξη και εφαρμογή γενετικών εργαλείων στο αρθρόποδο καρκινοειδές Parhyale hawaiensis
