Περίληψη |
Ένα από τα δημοφιλέστερα συστήματα έκφρασης ετερόλογων πρωτεϊνών είναι ο
μεθυλότροφος ζυμομύκητας Pichia pastoris. Αξιοποιώντας το μεταβολικό μονοπάτι της
ζύμης για το μεταβολισμό της μεθανόλης (Methanol Utilization pathway, MUt), και
συγκεκριμένα την ιδιότητα του προαγωγέα του ενζύμου της οξειδάσης της αλκοόλης
(AOX) να ενεργοποιείται μόνο όταν η μεθανόλη βρίσκεται στο περιβάλλον του
κυττάρου, μπορεί να πραγματοποιηθεί η αυστηρά ρυθμιζόμενη από μεθανόλη έκφραση
ετερόλογων πρωτεϊνών. Ώντας ευκαρυωτικός μικροοργανισμός, η P. pastoris προσφέρει
ένα πιο σύνθετο σύστημα έκφρασης πρωτεϊνών, σε σχέση με βακτηριακούς ξενιστές
όπως το E. coli, ενώ παράλληλα όντας ζύμη, είναι πιο φθηνό και λιγότερο χρονοβόρο
σύστημα από κύτταρα θηλαστικών.
Στο πλαίσιο της παρούσας ερευνητικής εργασίας πραγματοποιήθηκε η προσπάθεια
ετερόλογης έκφρασης πέντε υποθετικών και δύο γνωστών γλυκών πρωτεϊνών σε
σύστημα P. pastoris. Το πρώτο βήμα ήταν ο μετασχηματισμός τους στελέχους GS115 της
ζύμης με γραμμικό πλασμιδιακό φορέα pPIC9K. Στα επόμενα βήματα, προσδιορίστηκε ο
φαινότυπος MUts ή MUt+ των αποικιών μέσω πειραμάτων ανάπτυξης των
μετασχηματισμένων κυττάρων σε στερεές καλλιέργειες υπό συγκεκριμένες συνθήκες,
αλλά και ο γονότυπός τους, μέσω ανίχνευσης των επιθυμητών γονιδίων στο γονιδίωμα
της ζύμης με αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR). Τέλος, παρασκευάστηκαν
καλλιέργειες με στόχο την έκφραση των πρωτεϊνών ενδιαφέροντος και έγιναν
προσπάθειες απομόνωσής τους μέσω χρωματογραφίας συγγένειας. Μέσω της τεχνικής
ηλεκτροφήρησης σε αποδιατακτικές συνθήκες (SDS-PAGE), παρατηρήθηκε η έκφραση
των δύο πρωτεϊνών Μab II και MNEI, αλλά σε πολύ χαμηλές αποδόσεις.
|