| Περίληψη |
Πολλοί μύκητες και ωομύκητες, συμπεριλαμβανομένων μελών των γενών Phytophthora και Aphanomyces, έχουν την ικανότητα να προκαλούν ασθένειες σε διάφορα είδη φυτών. Η έλλειψη διαθέσιμων εργαλείων μοριακής γενετικής ανάλυσης αποτελεί τροχοπέδη στις έρευνες επί των μηχανισμών πρόκλησης ασθενειών από τους εν
λόγω μύκητες. Η γονιδιακή σίγηση επιτρέπει την στοχευμένη αναστολή της έκφρασης γονιδίων σε μετα-μεταγραφικό επίπεδο. Αυτή η μέθοδος αποτελεί ένα σύγχρονο εργαλείο γενετικής ανάλυσης για τους ευκαρυώτες και χρησιμοποιείται ευρέως στην διαλεύκανση
της αλληλεπίδρασης φυτών με τα παθογόνα τους. Σε αυτή τη διατριβή περιγράφονται οι προσπάθειες βελτιώσης και εφαρμογής μεθοδολογιών σίγησης σε ένα φυτοπαθογόνο ασκομύκητα (Colletotrichum higginsianum) και σε δύο φυτοπαθογόνους ωομύκητες
(Phytophthora parasitica και Aphanomyces euteiches).
Αρχικά για τη βελτίωση και εφαρμογή της μεθόδου της σίγησης επελέχθη ως γονίδιο αναφοράς το sGfp. Η στρατηγική που ακολουθήθηκε αφορούσε την αρχική εισαγωγή του γονιδίου στον μύκητα και στη συνέχεια την επαγωγή του μηχανισμού σίγησης στο μύκητα εισάγοντας ειδικά σχεδιασμένες σιγητικές κασέτες για το sGfp.
Σχεδιάστηκαν εκκινητές με περιοριστικές θέσεις EcoRI και απομονώσαμε με PCR τμήμα του sGfp 330nt. Το τμήμα αυτό κλωνοποίηθηκε στον φορέα pENTRY3C και στις δύο κατευθύνσεις, και εφαρμόζοντας δύο LR αντιδράσεις (μια για κάθε κατεύθυνση),
μεταφέρθηκε τελικά στον φορέα Gateway pK7GWIWG2(I),0 ώστε να προκύψουν δύο σιγητικές φουρκέτες (As/S and S/As). Αυτές οι δύο σιγητικές φουρκέτες μεταφερθηκαν στη συνέχεια σε δύο φορείς έκφρασης, τον pNC2 για την Phytophthora και τον δυαδικό
αγροβακτηριακό φορέα pBIG4MRBrev για το Colletotrichum. Επίσης σχεδιάστηκαν μια σειρά από άλλες sGfp κασέτες (sense και antisense) για σταθερό μετασχηματισμό με σκοπό την δημιουργία sGfp στελεχών και για την μετέπειτα σίγηση του ενδογενούς sGfp γονιδίου τους. Αναμένετο οι φουρκέτες και οι antisense κασέτες να δημιουργήσουν μόρια dsRNA και να επάγουν τον μηχανισμό σίγησης στο μύκητα για το γονίδιο αναφοράς sGfp. Επιχειρήθηκε η εισαγωγή του sGfp και των σιγητικών κασετών στους παραπάνω μικροοργανισμούς με μετασχηματισμό σε πρωτοπλάστες και με τη χρήση αγροβακτηρίου. Φαινομενικά θετικά στελέχη επιλέχθηκαν με βάση την ανθεκτικότητα
τους σε αντιβιοτικό και ελέχθηκαν για την παρουσία της πράσινης φθορίζουσας πρωτεΐνης κάτω από μικροσκόπιο παρουσία υπεριώδους.
Αποτελεσματική μέθοδος πρόκλησης της σίγησης παρέχει τη δυνατότητα μελέτης του βιολογικού ρόλου πιθανών παραγόντων παθογένειας των μυκήτων και γονιδίων των οποίων εμπλέκονται στην σύνθεση του κυτταρικού τους τοιχώματος. Σύμφωνα με την
επικρατούσα άποψη· βασικό χαρακτηριστικό των ωομυκήτων είναι η απουσία χιτίνης στο κυτταρικό τους τοίχωμα. Όμως, πρόσφατες έρευνες απέδειξαν την παρουσία χιτίνης όπως επίσης και γονίδια που εμπλέκονται στη σύνθεσή της (Chs) στην P. parasitica και στον
A. euteiches. Στην παρούσα διατριβή επιχειρήθηκε η απομόνωση Chs γονιδίων από την P. parasitica και τον A. euteiches, με σκοπό το σχεδιασμό σιγητικών κατασκευών για αυτά τα γονίδια. Απομονώθηκαν δύο πλήρους μήκους Chs cDNAs από τον A. euteiches,
που κωδικοποιούν τις συνθάσες ΑeCHS 1 και AeCHS 2, και ένα μερικού μήκους Chs cDNA από την P. parasitica (Ppn0_Chs) που κωδικοποιεί την πιο συντηρημένη περιοχή της πρωτεΐνης. Φυλογενετική ανάλυση έδειξε ότι τα Chs γονίδια αυτών των ωομυκήτων προέρχονται από διπλασιασμό ενός κοινού γονιδίου που έδωσε δύο διακριτές υποδιαιρέσεις για τα Chs γονίδια των φυτοπαθογόνων μυκήτων. Με βάση τα παραπάνω, σχεδιάστηκε γονιδιακή κασέτα (As) για το Ppn0_Chs γονίδιο.
|
Μετά-μεταγραφική γονιδιακή σίγηση σε μύκητες και ωομύκητες
