Your browser does not support JavaScript!

Αρχική    Μελέτη της προσαρμογής ενζύμων σε χαμηλές θερμοκρασίες: βιοχημική μελέτη δύο χιτινασών από το ψυχρόφιλο βακτήριο Arthrobacter sp str. TAD20  

Αποτελέσματα - Λεπτομέρειες

Προσθήκη στο καλάθι
[Προσθήκη στο καλάθι]
Κωδικός Πόρου uch.biology.phd//2002mavrommatis
Τίτλος Μελέτη της προσαρμογής ενζύμων σε χαμηλές θερμοκρασίες: βιοχημική μελέτη δύο χιτινασών από το ψυχρόφιλο βακτήριο Arthrobacter sp str. TAD20
Άλλος τίτλος Study of enzymes cold adaption: biochemical �study of two chitinases from the psychrophilic bacterium Arthrobacter sp. str. TAD20
Συγγραφέας Μαυρομμάτης, Κωνσταντίνος
Σύμβουλος διατριβής Μπουριώτης, Βασίλειος
Περίληψη Στην προσπάθεια μας να μελετήσουμε την επίδραση της τοπικής ευκαμψίας στην προσαρμογή των ενζύμων σε χαμηλές θερμοκρασίες σχεδιάσαμε σημειακές μεταλλάξεις με στόχο την μεταβολή της ευκαμψίας των πλευρικών ομάδων των αμινοξέων στο ενεργό κέντρο της αλκαλικής φωσφατάσης από το στέλεχος TAB5. Οι μεταλλάξεις βασίστηκαν σε πολλαπλές στοιχίσεις αλληλουχιών και την βοήθεια μοντέλου της τρισδιάστατης δομής. Οι μεταλλάξεις έγιναν στα κατάλοιπα Trp-260 και Ala-219 του καταλυτικού κέντρου και His-135 του σημείου πρόσδεσης του ιόντος Mg2+. Η αντικατάσταση της Trp-260 από Lys στη μεταλλαγμένη πρωτεΐνη W260K οδήγησε σε ένα λιγότερο ενεργό, συγκριτικά με το φυσικό ένζυμο, στο εύρος θερμοκρασιών 5-25oC. Η συμπληρωματική αντικατάσταση της Ala-219 από Asn στο διπλά μεταλλαγμένο ένζυμο W260K/A219N, οδηγεί σε δραστική αύξηση της ενέργειας ενεργοποίησης που αντικατοπτρίζεται στην μειωμένη ενεργότητα σε θερμοκρασίες 5-15oC και μια σημαντική αύξηση της ενεργότητας στους 20-25oC. Περεταίρω αντικατάσταση της His135 από Asp στο τριπλά μεταλλαγμένο ένζυμο W260K/A219N/H135D αποκαθιστά την χαμηλή ενέργεια ενεργοποίησης. Επιπλέον, η αντικατάσταση της His135 από Asp στις μεταλλάξεις H135D και W260K/A219N/H135D οδηγεί σε σημαντική σταθεροποίηση. Σχεδιάστηκαν σημειακές μεταλλάξεις με στόχο να μεταβάλλουν την συγκέντρωση των καταλοίπων Gly κοντά στο ενεργό κέντρο της προσαρμοσμένης στη χαμηλή θερμοκρασία αλκαλικής φωσφατάσης. Οι στόχοι των μεταλλάξεων είναι τα κατάλοιπα Gly-261 και Gly-262. Η αντικατάσταση της Gly-262 από Ala οδήγησε σε ανενεργό ένζυμο. Η αντικατάσταση της Gly-261 από Ala οδήγησε στη παραγωγή ενζύμου με μικρότερη σταθερότητα και αυξημένη ενέργεια ενεργοποίησης. Το διπλά μεταλλαγμένο ένζυμο G261A/Y269A σχεδιάστηκε με κριτήριο το πακετάρισμα των πλευρικών αλυσίδων από τη δομή του μοντέλου, και οδήγησε στην επαναφορά της ενέργειας ενεργοποίησης σε επίπεδα του φυσικού ενζύμου και σε ένζυμο με αυξημένη σταθερότητα συγκρίνοντας με το ένζυμο που φέρει τη μετάλλαξη G261A. Φαίνεται λοιπόν, ότι το σύμπλεγμα Gly σε συνδυασμό με το δομικό περιβάλλον παίζει σημαντικό ρόλο στην προσαρμογή του ενζύμου στις χαμηλές θερμοκρασίες. Αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι ο ψυχρόφιλος χαρακτήρας των μεταλλαγμένων ενζύμων μπορούν να εγκαθιδρυθούν ή να αποκρυπτούν από σημειακές αλλαγές της αλληλουχίας φυσικών ενζύμων, που μπορούν να επιδράσουν στην ευκαμψία του ενεργού κέντρου. Το γονίδιο που κωδικοποιεί την χιτινάση ArChiB από το βακτήριο της Ανταρκτικής Arthrobacter sp. TAD20 εκφράστηκε σε κύτταρα E.coli και το ανασυνδυασμένο ένζυμο απομονώθηκε σε ομοιογένεια. Στην προσπάθεια μας να δημιουργήσουμε βιοκαταλύτες που λειτουργούν σε υψηλές θερμοκρασίες μεταλλάσσοντας ένζυμα προσαρμοσμένα σε χαμηλές θερμοκρασίες, σχεδιάσαμε μεταλλάξεις που είχαν στόχο να αυξήσουν την ακαμψία του μορίου του ενζύμου, σε απομακρυσμένες από το ενεργό κέντρο περιοχές. Οι μεταλλάξεις σχεδιάστηκαν βασισμένες σε στοιχίσεις αλληλουχιών και σε μοντέλο δομής του ενζύμου, και περιλαμβάνουν την επαναφορά ενός δεσμού άλατος, και την αντικατάσταση επιλεγμένων καταλοίπων Gly από Pro ή Gln. Η επαναφορά του δεσμού άλατος στη μεταλλαγμένη πρωτεΐνη N198K οδήγησε σε πιο σταθερή πρωτεΐνη (?Tm=0.6 oC). Η μεταλλαγμένη πρωτεΐνη G93P εμφανίζει ?Tm 1.2 oC ενώ οι μεταλλαγμένες πρωτεΐνες G254P, G406Q εμφανίζουν μειωμένη σταθερότητα, υποδεικνύοντας ότι η επίδραση των μεταλλαγμένων καταλοίπων Gly, στη σταθερότητα, είναι πολυσύνθετο και εμφανίζεται σε συνδυασμό με το δομικό τους περιβάλλον. Μεταλλάξεις που έγιναν με στόχο να απομακρύνουν μια μοναδική σε αυτό το ένζυμο περιοχή ελεύθερης δομής, καθώς και τη δημιουργία ενός δισουλφιδικού δεσμού οδήγησαν σε ανενεργές πρωτεΐνες. Κινητικές και φωτομετρικές αναλύσεις αυτών των ενζύμων δείχνουν ότι οι κινητικές παράμετροι kcat and Km έχουν αλλάξει σημαντικά. Ο μηχανισμός δράσης των χιτινασών ArChiA και ArChiB από το βακτήριο Arthrobacter sp. strain TAD20 σε Ν-ακετυλχιτοολιγομερή και πολυμερή χιτίνης εξετάστηκε με τη χρήση HPLC. Η ArChiB αποδείχθηκε ότι είναι εξοχιτινάση που αφαιρεί Ν,Ν’- διακέτυλχιτοβιόζη από το μη ανάγων άκρο ενώ η ArChiA είναι ενδοχιτινάση που υδρολύει το υπόστρωμα χιτίνης σε τυχαίες θέσεις. Σε συγκέντρωση 100 μg/ml η ArChiB εμποδίζει την βλάστηση σπορίων και την επιμήκυνση υφών του φυτοπαθογόνου μύκητα Botrytis cinerea strain 309 κατά 15 % και 30 % αντίστοιχα. Με την ArChiA το φαινόμενο ήταν εντονότερο. Σε συγκεντρώσεις 100 μg/ml και 200 μg/ml η παρεμπόδιση της βλάστησης σπορίων ήταν 70 % and 90 % αντίστοιχα, ενώ 60 % και 90 % η παρεμπόδιση της επιμήκυνσης του σωλήνα αναπαραγωγής. Ο συνδυασμός των δύο ενζύμων σε συγκεντρώσεις 100 μg/ml οδήγησε σε 76 % και 53.8 % αναστολή της βλάστησης των σπορίων και της επιμήκυνσης των μυκητιακών υφών αντίστοιχα.
Γλώσσα Ελληνικά
Θέμα Χιτινάση; Αλκαλική φωσφατάση; Ψυχροφιλικότητα; Κατευθυνόμενη μεταλλαξογένεση; Βακτήρια
Ημερομηνία έκδοσης 2002-07-15
Συλλογή   Σχολή/Τμήμα--Σχολή Θετικών και Τεχνολογικών Επιστημών--Τμήμα Βιολογίας--Διδακτορικές διατριβές
  Τύπος Εργασίας--Διδακτορικές διατριβές
Εμφανίσεις 47

Ψηφιακά τεκμήρια
No preview available

Προβολή Εγγράφου
Εμφανίσεις : 2