Your browser does not support JavaScript!

Αρχική    Ανίχνευση άμεσων γονιδίων-στόχων του μεταγραφικού παράγοντα ERF  

Αποτελέσματα - Λεπτομέρειες

Προσθήκη στο καλάθι
[Προσθήκη στο καλάθι]
Κωδικός Πόρου 000347030
Τίτλος Ανίχνευση άμεσων γονιδίων-στόχων του μεταγραφικού παράγοντα ERF
Συγγραφέας Βερυκοκάκης, Μιχάλης
Σύμβουλος διατριβής Μαυροθαλασσίτης, Γιώργος
Μέλος κριτικής επιτροπής Οικονόμου, Τάσος
Ταλιανίδης, Γιάννης
Καραγωγέως, Δόμνα
Παπαματθαιάκης, Σήφης
Λούης, Κίτσος
Γραβάνης, Αχιλλέας
Περίληψη Ο ERF (Ets-2 Repressor Factor) είναι μεταγραφικός καταστολέας της οικογένειας των ETS γονιδίων, ο οποίος ρυθμίζεται από το μονοπάτι Ras/Erk. Το 2.8kb mRNA του Erf εκφράζεται ομοιόμορφα σε όλους τους ιστούς και τις κυτταρικές σειρές που έχουν μέχρι τώρα ελεγχθεί, εκτός από το πλακούντα. Αλληλεπιδρά in vitro και in vivo ειδικά με την Erk κινάση, τόσο με την ενεργό φωσφωρυλιωμένη μορφή της όσο και με την ανενεργή. Αυτή η αλληλεπίδραση διαμεσολαβείται από δύο ξεχωριστά FXF μοτίβα στο κεντρικό τμήμα της Erf πρωτεϊνης, χαρακτηριστικά των υποστρωμάτων της Erk. Τα δύο αυτά μοτίβα δείχνουν διαφορετική προτίμηση για την πρόσδεση με την ενεργό ή την ανενεργό Erk κινάση, όπως έχει φανεί από ανάλυση σημειακών μεταλλαγών. Η ενεργός Erk, ωστόσο, αλληλεπιδρά με τον Erf με 5 περίπου φορές ισχυρότερη συγγένεια πρόσδεσης σε σχέση με την ανενεργό μορφή της. Η Erk-διαμεσολαβούμενη φωσφωρυλίωση του Erf έχει ως αποτέλεσμα την αλλαγή του υποκυτταρικού εντοπισμού του. Έτσι, η φωσφωρυλιωμένη μορφή του Erf (κάτω από συνθήκες που η Erk είναι ενεργή) βρίσκεται στο κυτταρόπλασμα, ενώ όταν το Ras/Erk μονοπάτι αναστέλλεται, τότε ο Erf συσσωρεύεται γρήγορα στον πυρήνα, αποφωσφωρυλιώνεται και ασκεί τη δράση του ως μεταγραφικός παράγοντας. Μεταλλαγμένη μορφή του Erf, στην οποία και οι εφτά θέσεις φωσφωρυλίωσης έχουν μεταλλαχθει σε αλανίνη (Erf M1-7), καθιστά την πρωτεϊνη μονίμως πυρηνική. Αντίστοιχο φαινότυπο δείχνει και η μεταλλαγμένη μορφή του Erf που είναι ελαττωματική για την πρόσδεση στην Erk κινάση, αποδεικνύοντας ότι ο Erf είναι ειδικό υπόστρωμα της Erk. Υπερέκφραση της Erf M1-7 πρωτεϊνης σε ινοβλάστες οδηγεί τα κύτταρα σε αναστολή του κυτταρικού τους κύκλου στη φάση G1, ενώ η αγρίου τύπου πρωτεϊνη δεν έχει επίδραση. Η δράση αυτή εξαρτάται άμεσα από την παρουσία της πρωτεϊνης του Ρετινοβλαστόματος, αφού κύτταρα με έλλειψή της δεν αναστέλλονται από την Erf M1-7, ενώ η υπερέκφραση των κυκλινών D1 και E αναιρεί τη ανασταλτική δραστηριότητα του Erf. Επιπλέον, η Erf M1-7 πρωτεϊνη, όπως και η ελαττωματική, ως προς τη δέσμευση με την Erk, πρωτεϊνη του Erf αντιστρέφει το Ras-επαγώμενο μετασχηματισμό των ινοβλαστών, παρέχοντας ενδείξεις ότι ο Erf μπορεί να έχει ογκοκατασταλτική λειτουργία, πέρα από το φυσιολογικό κυτοστατικό του ρόλο. Η δημιουργία στο εργαστήριο ποντικών με έλλειψη του Erf παρείχε περαιτέρω στοιχεία για την in vivo δραστηριότητά του. Τα Erf-/- ποντίκια δεν είναι βιώσιμα πέρα από το στάδιο 10-10.5dpc της εμβρυικής ζωής, εξαιτίας σοβαρών προβλημάτων στην ανάπτυξη του πλακούντα. Συγκεκριμένα, στους πλακούντες των Erf-/- εμβρύων παρατηρείται μία συμπαγής χοριακή στοιβάδα, αγενεσία του λαβυρίνθου, μία εκτεταμένη στοιβάδα γιγαντιαίων κυττάρων και μία μικρότερη σπογγώδης στοιβάδα. Επίσης, παρατηρείται απουσία των μεταμιτωτικών κυττάρων του χορίου και των συγκυτιοκυττάρων που αποτελούν τα τελικά διαφοροποιημένα κύτταρα του λαβυρίνθου. Αντίθετα, υπάρχει αυξημένη έκφραση γονιδίων-δεικτών των αρχέγονων τροφοβλαστικών κυττάρων που παραμένουν αδιαφοροποίητα. Επομένως, ο Erf φαίνεται ότι συμμετέχει στη διαφοροποίηση των τροφοβλαστικών κυττάρων και την ανάπτυξη συγκεκριμένων κυτταρικών τύπων που οδηγούν στην πλακουντογένεση. Ενώ η ρύθμιση και ο φυσιολογικός ρόλος του Erf έχουν αρχίσει να αποκαλύπτονται, ελλιπής είναι η γνώση σχετικά με τα γονίδια-στόχους του και το μοριακό μηχανισμό δράσης του. Σε αυτή τη μελέτη, πραγματοποιήθηκε προσπάθεια ταυτοποίησης των γονιδίων που ρυθμίζει άμεσα ο Erf και ανίχνευσης του μηχανισμού μεταγραφικής καταστολής. Δημιουργήθηκαν πρωτογενείς κυτταρικές καλλιέργειες από εμβρυικούς ινοβλάστες ποντικών αγρίου τύπου ή με έλλειψη του Erf και αναπτύχθηκαν είτε σε πλήρες θρεπτικό υλικό (ανενεργός Erf), είτε σε απουσία ορού για τέσσερεις ώρες (ενεργός Erf). Στη συνέχεια έγινε σύγκριση των μεταγραφικών προτύπων τους με υβριδοποίηση μικροσυστοιχειών cDNA. Η ανάλυση των αποτελεσμάτων αποκάλυψε 14 συνολικά γονίδια των οποίων η έκφραση αυξάνεται ελλείψει του Erf, σε συνθήκες που αυτός βρίσκεται στον πυρήνα των κυττάρων και είναι ενεργός (δηλαδή απουσία ορού). Δύο από αυτά, το c-Myc και το Olig1, διερευνήθηκαν περαιτέρω αν αποτελούν άμεσους στόχους του Erf. Το c-Myc επιλέχθηκε διότι είναι συμβατό με τη μέχρι στιγμής γνωστή λειτουργία και τη ρύθμιση του Erf και το Olig1 επειδή έδειξε την υψηλότερη ενεργοποίηση απουσία του Erf (περίπου 5,5 φορές). Αφού επιβεβαιώθηκε, με ημιποσοτική αντίδραση PCR πραγματικού χρόνου (RT-qPCR), ότι τα επίπεδα του mRNA του c-Myc αυξάνονται απουσία του Erf, δείχθηκε με ανοσοκατακρήμνιση χρωματίνης και qPCR ότι ο ενδογενής Erf προσδένεται στον υποκινητή του c-Myc σε συνθήκες έλλειψης ορού. Επιπρόσθετα σύγκριση αγρίου τύπου με Erf-/- εμβρύων και πλακούντων έδειξε υπερέκφραση του c-Myc ελλείψει του Erf. Επιπλέον, με δοκιμασία λουσιφεράσης φάνηκε ότι ο Erf αγρίου τύπου καταστέλλει την, καθοδηγούμενη από το c-Myc υποκινητή, μεταγραφή σε συνθήκες έλλειψης ορού. Η δράση αυτή εξαρτάται από την κατασταλτική περιοχή του Erf και την περιοχή πρόσδεσης στο DNA, συνιστώντας μία άμεση και ενεργή δράση του Erf στη μεταγραφική καταστολή του c-Myc. Επαγώμενη υπερέκφραση του αγρίου τύπου Erf ή του Erf M1-7 σε ινοβλάστες προκαλεί τη μείωση του c-Myc mRNA σε συνθήκες έλλειψης ορού ή και σε κανονικές συνθήκες αύξησης, αντίστοιχα. Υπερέκφραση του Erf M1-7 αλλά όχι και του Erf wt στα Ras- μετασχηματισμένα κύτταρα οδηγεί σε μείωση του c-Myc mRNA, παρέχοντας μία ένδειξη ότι το c-Myc βρίσκεται καθοδικά του Erf. Επιπλέον, χρησιμοποιώντας σταθερά διαμολυσμένα MCF7 κύτταρα, των οποίων ο μετασχηματισμός εξαρτάται από το c-Myc, δείχθηκε ότι ο Erf Μ1-7 ελαττώνει το c-Myc mRNA και αντιστρέφει το μετασχηματισμένο φαινότυπο σε συνθήκες μειωμένου ορού. Τέλος, για να διαλευκανθεί γιατί ο Erf δεν αναστέλλει τον κυτταρικό κύκλο απουσία του Rb, ελέγχθηκαν τα επίπεδα του c-Myc mRNA και η πρόσδεση του Erf στον υποκινητή του. Έτσι φάνηκε ότι απουσία ορού τα επίπεδα του c-Myc mRNA δεν μειώνονται στα Rb-/- κύτταρα (αν και είναι ήδη πολύ χαμηλά σε σχέση με τα αγρίου τύπου κύτταρα), ενώ συγχρόνως ο Erf δεν μπορεί να αλληλεπιδράση με τον υποκινητή του c-Myc ανεξάρτητα από τις συνθήκες ανάπτυξης. Τα παραπάνω, σε συνδυασμό με το γεγονός ότι σε ινοβλάστες με έλλειψη του c-Myc, η Erf Μ1-7 πρωτεϊνη δεν μπορεί να αναστείλει τον κυτταρικό κύκλο, παρέχουν ισχυρές ενδείξεις ότι ο υποκινητής του c-Myc γονιδίου αποτελεί άμεσο στόχο του Erf μεταγραφικού καταστολέα και εξηγούν το μηχανισμό της φυσιολογικής δράσης του Erf. Παράλληλα, επιβεβαιώθηκε ότι και το Olig1 mRNA αυξάνεται απουσία του Erf σε συνθήκες έλλειψης ορού. Πειράματα ανοσοκατακρήμνισης της χρωματίνης έδειξαν ότι ο Erf αλληλεπιδρά in vivo με τον υποκινητή του Olig1, απουσία ορού. Εν συνεχεία κλωνοποιήθηκε η 5’ περιοχή του γονιδίου και δείχθηκε με δοκιμασίες λουσιφεράσης, αφενός ότι παρουσιάζει μεταγραφική ενεργότητα και αφεταίρου ότι ο Erf καταστέλλει αυτή την ενεργότητα με ένα TSA-εξαρτώμενο τρόπο. Τα παραπάνω αποτελούν ενδείξεις ότι ο Erf ρυθμίζει άμεσα τον Olig1 υποκινητή, ωστόσο περισσότερη ανάλυση είναι απαραίτητη για να αποδειχθεί αυτή η υπόθεση. Προκειμένου να αντληθούν επιπρόσθετα στοιχεία για τη ρύθμιση της δράσης του Erf, διερευνήθηκε η αλληλεπίδρασή του με τους συγκαταστολείς Hipk1 και Ring1Β. Οι δυο παραπάνω πρωτεϊνες είχαν ανιχνευθεί ως αλληλεπιδρώσες, με τον Erf, πρωτεϊνες σε σάρωση με το σύστημα των δύο υβριδίων στο σακχαρομύκητα. Η αλληλεπίδραση του Erf με την Ring1B δεν επιβεβαιώθηκε σε κύτταρα θηλαστικών. Αντίθετα, ο Erf wt, αλλά και ο Erf M1- 7, αλληλεπιδρούν με την κινάση-συγκαταστολέα Hipk1, καθώς και με ένα κυρίαρχα αρνητικό της μετάλλαγμα (Hipk1KR, ελαττωματικό για την ενεργότητα κινάσης). Χαρτογράφηση της περιοχής αλληλεπίδρασης έδειξε ότι το αμινοτελικό τμήμα του Erf και συγκεκριμένα το τμήμα 100-202αα είναι υπεύθυνο για την πρόσδεση στην Hipk1. Επιπλέον, η Hipk1 και η Hipk2 φωσφωρυλιώνουν το αμινοτελικό ακρο του Erf in vitro, όχι όμως και την κεντρική και καρβοξυτελική του περιοχή, σε συνέπεια με τα δεδομένα από τα πειράματα αλληλεπίδρασης. Ωστόσο, δεν είναι γνωστό ποια κατάλοιπα φωσφωρυλιώνονται. Σε δοκιμασίες λουσιφεράσης χρησιμοποιώντας είτε ετερόλογους GAL4-καθοδηγούμενους SV40 υποκινητές αναφοράς, είτε το c- Myc υποκινητή φάνηκε ότι η Hipk1 και η Hipk2 αναιρούν την κατασταλτική δράση του Εrf. Πρέπει να τονιστεί ότι οι Hipk1KR και Hipk2KR πρωτεϊνες δεν έχει καμία επίδραση στην Erf-διαμεσολαβούμενη μεταγραφική καταστολή. Πειράματα υποκυτταρικού εντοπισμού της GFP-ERF συντηγμένης πρωτεϊνης παρουσία των Hipk1/2, έδειξαν ότι ο Erf μετατοπίζεται μερικώς στο κυτταρόπλασμα, εξηγώντας έτσι την αρνητική επίδραση της στη δράση του Erf, ενώ παρουσία των Hipk1/2KR ο υποκυτταρικός εντοπισμός του Erf δεν επηρεάζεται. Τέλος, μελετήθηκε η ειδικότητα της αλληλεπίδραση Erf-Erk in vivo. Τμήματα της κεντρική περιοχής του Erf υπερέκφράστηκαν και η σηματοδότηση του Ras/Erk μονοπατιού εξετάστηκε με βάση την υποκυτταρική κατανομή της GFP-ERF υβριδικής πρωτεϊνης. Έτσι το τμήμα 294-425 αναστέλλει αποτελεσματικά το Ras/Erk σηματοδοτικό μονοπάτι, χωρίς να επηρεάζει την ενεργότητα της Erk κινάσης. Η αλλαγή στην υποκυτταρική κατανομή του Erf οφείλεται στη μειωμένη φωσφωρυλίωσή του, όπως φαίνεται από ανοσοφθορισμό με ειδικό αντίσωμα που αναγνωρίζει τη φωσφωρυλιωμένη του μορφή. Επιπλέον, ο Elk-1 μεταγραφικός παράγοντας καθώς και η κινάση Rsk2 (που αποτελούν υποστρώματα της Erk κινάσης) απενεργοποιούνται παρουσία του τμήματος 294-425 του Erf. Τα παραπάνω υποστηρίζουν την άποψη ότι ο Erf αποτελεί ειδικό υπόστρωμα της Erk κινάσης και μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως ειδικός αναστολέας του μονοπατιού Ras/Erk.
Φυσική περιγραφή iv, 183 σ. : πιν. ; 30 εκ.
Γλώσσα Ελληνικά
Θέμα Proteins
Πρωτεϊνες
Ημερομηνία έκδοσης 2007-07-26
Συλλογή   Σχολή/Τμήμα--Σχολή Επιστημών Υγείας--Τμήμα Ιατρικής--Διδακτορικές διατριβές
  Τύπος Εργασίας--Διδακτορικές διατριβές
Σημειώσεις Διατμηματικό-μεταπτυχιακό πρόγραμμα σπουδών Μοριακής Βιολογίας-Βιοϊατρικής
Εμφανίσεις 61

Ψηφιακά τεκμήρια
No preview available

Προβολή Εγγράφου
Εμφανίσεις : 7