| Περίληψη |
Η αθηροσκλήρωση είναι μια πολύπλοκη πολυπαραγοντική νόσος των μεσαίου και μεγάλου μεγέθους αρτηριών, η οποία έχει σαν αποτέλεσμα την προοδευτική συσσώρευση λείων μυϊκών κυττάρων, λιπιδίων και συνδετικού ιστού στον έσω χιτώνα και η οποία συνδέεται με πολλούς περιβαλλοντικούς παράγοντες κινδύνου αλληλεπιδρώντες με το γενετικό υπόβαθρο του ατόμου.
Συνεχώς αυξανόμενα στοιχεία προκύπτουν σχετικά με τον φλεγμονώδη χαρακτήρα της αθηροσκλήρωσης. Διάφοροι προφλεγμονώδεις παράγοντες, χημειοτακτικές κυττοκίνες (χημοκίνες), συνδετικά μόρια παίζουν σημαντικό ρόλο στη ενορχήστρωση της συνολικής διαδικασίας. Υπάρχει αυξανόμενο ενδιαφέρον στη σύγχρονη βιβλιογραφία σχετικά με το ρόλο των χημοκινών στην αθηροσκλήρωση, εξαιτίας της εμπλοκής τους σε σημαντικές απόψεις της αθηρογένεσης, όπως την επιστράτευση φλεγμονωδών κυττάρων στο αγγειακό τοίχωμα και τον πολλαπλασιασμό λείων μυϊκών κυττάρων στις αθηροσκληρωτικές πλάκες.
Η Ιντερλευκίνη 8 (IL-8), πρότυπη χημοκίνη της υποομάδας CXC φαίνεται να εμπλέκεται στην αγγειακή παθολογία. Με βάση βιβλιογραφικά δεδομένα, συγκεκριμένοι πολυμορφισμοί στα γονίδια της χημοκίνης CXCL8 (IL-8) και των υποδοχέων της ενέχονται στην κλινική εκδήλωση άλλων νοσημάτων όπως το βρογχικό άσθμα, η Πολλαπλή Σκλήρυνση και η RSV λοίμωξη.
Σ' αυτό το πλαίσιο εξετάστηκαν δύο από τους πέντε γνωστούς πολυμορφισμούς, οι -251 Α/Τ και 781 C/T του εκκινητή του γονιδίου της IL-8 και η συχνότητα εμφάνισής τους σε σχέση με την ύπαρξη ή μη στεφανιαίας νόσου.
Για το σκοπό αυτό συγκεντρώθηκαν δείγματα αίματος από 300 στεφανιαίους ασθενείς (CAD patients) και 189 υγιείς μάρτυρες (Controls), στεφανιογραφικά ελεγμένους. Τα δείγματα DNA κατατάχθηκαν σε ομόζυγα και ετερόζυγα ως προς τον υπό μελέτη πολυμορφισμό. Επιπλέον έγινε επιβεβαίωση της ύπαρξης και της θέσης του πολυμορφισμού -251 Α/Τ με τη μέθοδο της αλληλούχισης (Sequencing). Στη διαδικασία γονοτυπικής- φαινοτυπικής συσχέτισης συμπεριλήφθηκαν 241 άτομα από τους ασθενείς και 157 άτομα από τους υγιείς μάρτυρες. Στον ίδιο πληθυσμό καταγράφηκε και η κλινική μορφή εμφάνισης της στεφανιαίας νόσου (σταθερή-ασταθής στηθάγχη, οξύ έμφραγμα του μυοκαρδίου). Με αυτόν τον τρόπο ήταν δυνατή η περαιτέρω κατάταξη των μελών της ομάδας των ασθενών σε δύο υποομάδες: α. Ασθενείς με Οξύ Στεφανιαίο Σύνδρομο (ACS group, n=121) και β. Ασθενείς με σταθερή νόσο (non ACS group, n=120). Η ανάλυση έδειξε ισχυρή συσχέτιση μεταξύ των δύο γονιδιακών τόπων (D'=0.93).
Επίσης παρατηρείται επικράτηση των ομόζυγων ως προς το 251A αλληλόμορφο ατόμων στην ομάδα των non-ACS ασθενών εν συγκρίσει με την ομάδα των ACS ασθενών (OR=0.49, 95% CI: 0.24-1.0, p=0.07). Μία επικράτηση του AA<1sub>1251<sub>1TT<sub>1781</subgt; συνδυασμένου γονοτύπου παρατηρήθηκε επιπλέον στην ομάδα των non-ACS ασθενών (OR=0.43, 95% CI: 0.19-0.97, p=0.04).
Η συνολική εργασία καταλήγει στο συμπέρασμα ότι ο κοινός AA251TT781 γονότυπος σχετίζεται με μειωμένο κίνδυνο οξέος στεφανιαίου συνδρόμου σε διαγνωσμένους στεφανιαίους ασθενείς. Φάνηκε επίσης η συμμετοχή της IL-8 στις βιοχημικές διαδικασίες οι οποίες οδηγούν σε οξέα στεφανιαία σύνδρομα.
Στη συνέχεια εξετάστηκε η συσχέτιση της παρουσίας των δυο αυτών πολυμορφισμών (-251 Α/Τ και 781 C/T του εκκινητή του γονιδίου της IL-8) με την προδιάθεση για εμφάνιση επαναστένωσης μετά από Διαδερμική Ενδοστεφανιαία Παρέμβαση.
Συγκεκριμένα ελέγχθηκε η επικράτηση των παραπάνω SNP's σε 201 ασθενείς με ΣΝ οι οποίοι είχαν υποβληθεί σε PCI και επανεμφάνισαν σημεία ισχαιμίας. Μετά από αγγειογραφικό επανέλεγχο, οι ασθενείς κατατάχθηκαν σε 2 υποομάδες ανάλογα με την παρουσία ή μη επαναστένωσης ISR ( >150% μείωση της διαμέτρου του αγγείου κατά τον επανέλεγχο): 1) ISR group (n=73) και 2) non-ISR group (n=128). Δεν βρέθηκαν στατιστικά σημαντικές διαφορές, όσον αφορά τη συχνότητα των δύο υπό μελέτη πολυμορφισμών, ανάμεσα στις δύο υποομάδες. Παρ' όλα αυτά, παρατηρήθηκε στατιστικά σημαντική αύξηση της συχνότητας του συνδεδεμένου γονοτύπου TT<sub>1251</sub>TT<sub>181</sub>1 στους ασθενείς με επαναστένωση, γεγονός το οποίο υποδηλώνει ότι η γενετική ποικιλότητα του γονιδίου της IL-8 επηρεάζει με κάποιον τρόπο την τάση προς επαναστένωση μετά από PCI.
Επιπλέον, στα πλαίσια του δευτέρου μέρους της Διδακτορικής Διατριβής, μελετήθηκε η έκφραση της IL-8 και των υποδοχέων αυτής, σε καλλιέργεια κυτταρικής σειράς μονοκυττάρων (THP-1). Η καλλιέργεια και επώαση των κυττάρων έγιναν σε θρεπτικό μέσο αποτελούμενο από RPMI, HEPES, GLUTAMIN, FBS και αντιβιοτικά Πενικιλίνη και Στρεπτομυκίνη ενώ οι περισσότεροι χρόνοι επώασης αναφέρονται σε 24 ώρες. Μετά την 24ωρη επώαση και μετά την φυγοκέντρηση των καλλιεργειών για τη λήψη της κυτταρικής πελέτας, το υπερκείμενο υγρό διαχωρίζονταν και ψυχόταν στους -20°C, προκειμένου να χρησιμοποιηθεί για τη μέτρηση της έκφρασης IL-8 από τα κύτταρα.
Αρχικά, καλλιεργήθηκαν THP-1 κύτταρα υπό την επίδραση φλεγμονωδών παραγόντων όπως λιποπολυσακχαρίτη (LPS), AngI και AngIl και μετρήθηκε η έκφραση των υποδοχέων CXCR1 και CXCR2 της IL-8. Η επώαση πραγματοποιήθηκε για διάστημα 24 και 72 ωρών και κατόπιν προσδιορίστηκε ποιοτικά και ποσοτικά η έκφραση των μελετώμενων υποδοχέων. Η μέτρηση των υποδοχέων έγινε με Κυτταρομετρία Ροής (FACS) κατόπιν σήμανσής τους με φθορίζοντα αντισώματα. Αυτό που παρατηρήθηκε κατά τη διαδικασία αυτή ήταν μικρή αύξηση των υποδοχέων της IL-8 κατά την επώαση (24 ώρες) των κυττάρων με LPS ενώ οι AngI και AngIl δεν έδειξαν να προκαλούν σημαντική διαφοροποίηση στην έκφρασή τους. Σημαντική διαφορά δεν παρατηρήθηκε ούτε στη δοκιμασία με επώαση 72 ωρών.
Στη συνέχεια, έγινε προσπάθεια αναστολής της δράσης του LPS με τη χρήση φαρμάκων και αντιφλεγμονοδών ουσιών. Χρησιμοποιήθηκαν, αρχικά, Καπτοπρίλη, Λισινοπρίλη και Λοζαρτάνη. Πρόκειται για 3 φάρμακα χρησιμοποιούμενα στην αντιμετώπιση της ΣΝ. Τα δύο πρώτα (Captopril, Lisinopril) αποτελούν Αναστολείς του Μετατρεπτικού Ενζύμου της Αγγειοτενσίνης (α-ΜΕΑ), ενώ η Losartan είναι Ανταγωνιστής του υποδοχέα για την Angll. Πραγματοποιήθηκε λοιπόν, επώαση των THP-1 κυττάρων με LPS και ταυτόχρονα με LPS και κάθε μία από τις τρείς προαναφερθείσες ουσίες. Οι
δύο ΑΜΕΑ δεν έδειξαν να επηρεάζουν σημαντικά τα κύτταρα και την έκφραση των υποδοχέων. Αντίθετα, η Losartan προκάλεσε μια σταθερή, επαναλαμβανόμενη, σημαντική και δοσοεξαρτώμενη αύξηση της έκφρασης του υποδοχέα CXCR1 και λιγότερο του CXCR2 μετά από 24 ώρες επώαση. Το αποτέλεσμα αυτό προκάλεσε την ανάγκη για περαιτέρω διερεύνηση της επίδρασης της Λοζαρτάνης καθώς και άλλων φαρμάκων της ίδιας κατηγορίας στην έκφραση των μελετώμενων υποδοχέων καθώς βέβαια και της IL-8. Χρησιμοποιήθηκαν, για την πραγματοποίηση των ίδιων πειραμάτων, άλλα δύο φάρμακα της κατηγορίας των ανταγωνιστών του υποδοχέα της AngIl, η Τελμιζαρτάνη και η Καντεζαρτάνη (Telmisartan- Candesartan) εκ των οποίων το πρώτο έδωσε αντίστοιχα με τη Losartan αποτελέσματα, ενώ, επώαση των κυττάρων με το δεύτερο δεν φάνηκε να επηρεάζει την έκφραση των υποδοχέων. Κατόπιν, στις κυτταρικές καλλιέργειες προστέθηκαν για άλλη μια φορά οι φλεγμονώδεις ουσίες AngI και AngIl προκειμένου να μελετηθεί η δράση τους σε συνδυασμό με τα υπό μελέτη φάρμακα. Παρατηρήθηκε μικρή μείωση της έκφρασης των υποδοχέων CXCR1 και CXCR2 κατά την επώαση των κυττάρων με AngIl και Λοζαρτάνη, σε σύγκριση με την έκφρασή τους μετά από επώαση μόνο με Λοζαρτάνη ή Τελμιζαρτάνη. Δεν επαναλήφθηκε το ίδιο με την AngI ή με κάποια άλλη φαρμακευτική ουσία. Το γεγονός αυτό οδήγησε στη σκέψη πιθανής δράσης τόσο της AngIl όσο και της Λοζαρτάνης σε κοινό υποδοχέα.
Επιπρόσθετα, έγινε και μέτρηση της έκφρασης της IL-8 υπό κάθε μία από τις παραπάνω συνθήκες, με τη μέθοδο ELISA. Στη φάση αυτή επιστρατεύτηκαν τα υπερκείμενα διαλύματα που είχαν φυλαχθεί ακριβώς για τον σκοπό αυτό. Η μέτρηση της έκφρασης της IL-8 σε υπερκείμενο κυττάρων καλλιεργημένων σε φλεγμονώδεις συνθήκες καθώς και σε συνθήκες επίδρασης με φάρμακα, έδειξε σημαντική αύξηση της έκφρασης της IL-8 υπό την επίδραση και των τριών φλεγμονωδών ουσιών (LPS, AngI και AngIl) και αντίστοιχη μείωση των τιμών αυτών κατά την προσπάθεια αναστολής της φλεγμονής με τα χρησιμοποιούμενα φάρμακα. Επιπλέον διαφάνηκε και πάλι η τάση για αναστολή της δράσης της Λοζαρτάνης από την παρουσία της AngIl.
Τα παραπάνω πειράματα σκιαγραφούν πιθανούς γενετικούς και κυτταρικούς μηχανισμούς μέσω των οποίων μια φλεγμονώδης ουσία (IL-8) μπορεί να επηρεάσει και να επηρεαστεί κατά τη διάρκεια της πολύπλοκης διαδικασίας της αθηροσκλήρωσης.
|
Ο ρόλος της χημοκίνης CXCL8 (IL-8) και των υποδοχέων της CXCR1 και CXCR2 στην παθογένεια της στεφανιαίας νόσου
