| Περίληψη |
Οι πρωτεΐνες Fras1/Frem αποτελούν μία οικογένεια δομικά συγγενικών εξωκυττάριων πρωτεϊνών, που περιλαμβάνει τις πρωτεΐνες Fras1, Frem1, Frem2 και Frem3. Με την εξαίρεση της Frem3, η απενεργοποίησή τους ξεχωριστά στον ποντικό οδηγεί σε παρόμοιο φαινότυπο, το λεγόμενο ‘bleb’, που χαρακτηρίζεται από την αποκόλληση της επιδερμίδας από τη δερμίδα κατά την εμβρυϊκή ανάπτυξη, με αποτέλεσμα το σχηματισμό υπο-επιδερμικών πομφολυγών, κρυπτοφθαλμία, συνδακτυλίες και νεφρικές διαταραχές.
Στην παρούσα εργασία, δεδομένης της δομικής ομολογίας των Fras1/Frem και των παρόμοιων φαινοτυπικών διαταραχών που προκύπτουν από την απενεργοποίησή τους, πραγματοποιήθηκε μία ανοσοϊστοχημική μελέτη εντοπισμού τους κατά την εμβρυϊκή ανάπτυξη του ποντικού, ώστε να διαπιστωθεί κατά πόσο παρόμοιο είναι και το πρότυπο εντοπισμού τους στα εμβρυϊκά στάδια. Πράγματι, διαπιστώθηκε ότι η τοπολογία τους είναι κοινή, καθώς όλες εντοπίστηκαν στη βασική μεμβράνη μιας πληθώρας επιθηλιακών δομών. Επιπλέον, η Frem1 εμφάνισε ένα ενδοκυτταρικό πρότυπο έκφρασης στα περιδερμικά κύτταρα της επιδερμίδας. Σε παράλληλα πειράματα, το κολλαγόνο VII, του οποίου η απενεργοποίηση οδηγεί σε παρόμοιο φαινότυπο με αυτό των Fras1/Frem, με τη διαφορά ότι αυτός παρατηρείται μόνο μετά τη γέννηση, ανιχνεύτηκε στα όψιμα στάδια της εμβρυϊκής ανάπτυξης, όταν τα επίπεδα των Fras1/Frem αρχίζουν να φθίνουν. Το γεγονός αυτό μας οδήγησε στην υπόθεση ότι το ρόλο των Fras1/Frem κατά την εμβρυϊκή ανάπτυξη τον διαδραματίζει το κολλαγόνο VII στον ενήλικα οργανισμό και το αντίθετο.
Στην κατανόηση της λειτουργικής δράσης των πρωτεϊνών συμβάλλει και η ταυτοποίηση των αλληλεπιδράσεων στις οποίες συμμετέχουν. In vivo παρατηρήσεις που αφορούσαν την απώλεια του αγγειογενετικού αυξητικού παράγοντα VEGF από τη βασική μεμβράνη των επιθηλίων των Fras1-/- έμβρύων, μας οδήγησαν στη διερεύνηση της αλληλεπίδρασης των πρωτεϊνών Fras1 και VEGF. Στα πειράματά μας αποδείχθηκε για πρώτη φορά, ότι τα έξι πρώτα πρωτεϊνικά μοτίβα τύπου χορδίνης της Fras1 αλληλεπιδρούν με τον VEGF, και ταυτοποιήθηκαν οι περιοχές της Fras1 και του VEGF που είναι κρίσιμες για την αλληλεπίδραση αυτή. Τα σύστηματα μελέτης που χρησιμοποιήθηκαν ήταν τα πολωμένα επιθηλιακά κύτταρα mIMCD και το ετερόλογο σύστημα δύο υβριδίων στο σακχαρομύκητα. Δεδομένου ότι ο VEGF διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στη δημιουργία νεοπλασιών, πραγματοποιήθηκε επιπλέον ο προσδιορισμός του προτύπου έκφρασης της Fras1 και των υπολοίπων πρωτεϊνών Fras1/Frem σε χημικά επαγώμενους όγκους της επιδερμίδας. Διαπιστώθηκε ότι το μοναδικό μέλος της οικογένειας που ανιχνεύεται στη βασική μεμβράνη των νεοπλαστικών επιθηλίων και των παθολογικών αιμοφόρων αγγείων του συνδετικού ιστού είναι η πρωτεΐνη Frem3. Με πειράματα in situ υβριδισμού διαπιστώθηκε ότι το γονίδιο Frem3 εκφράζεται από τα καρκινικά επιθήλια.
Εκτός από τον VEGF, η πρωτεΐνη Fras1 αλληλεπιδρά μέσω του καρβοξυτελικού της άκρου με την κυτταροπλασματική πρωτεΐνη Grip1, η οποία τη στοχεύει προς έκκριση στη βασικοπλευρική μεριά των επιθηλίων. Στα πλαίσια της 4
μελέτης της αλληλεπίδρασης αυτής, βρέθηκε ότι κατά τη συνέκφραση των Fras1 και Grip1 σε ευκαρυωτικά κύτταρα, πραγματοποιείται μία αναδιοργάνωση του ενδοπλασματικού δικτύου των κυττάρων, με αποτέλεσμα να συγκεντρώνεται στις περιοχές συνεντοπισμού των δύο παραπάνω πρωτεϊνών. Η αναδιοργάνωση αυτή χαρακτηρίστηκε με συγκεκριμένους ενδοκυτταρικούς μάρτυρες και ταυτοποιήθηκαν οι περιοχές των δύο πρωτεϊνών που είναι υπεύθυνες για την πρόκληση του φαινόμενου αυτού. To γεγονός ότι η Frem2, μία πρωτεϊνη της οικογένειας των Fras1/Frem πρωτεϊνών που έχει δειχθεί in vitro ότι αλληλεπιδρά με τη Grip1 δεν φάνηκε στις μελέτες μας να προκαλεί αντίστοιχο φαινόμενο, φανερώνει ότι η Fras1 είναι η μοναδική πρωτεΐνη της οικογένειας Fras1/Frem που πιθανόν εμπλέκεται στον καθορισμό της κυτταρικής δομής.
|
Λειτουργική μελέτη των πρωτεινών της οικογένειας Fras1/Frem σε φυσιολογικές και παθολογικές καταστάσεις
