| Περίληψη |
Ένας βασικός στόχος του Προγράμματος ανάλυσης του Ανθρώπινου Γονιδιώματος είναι η ταυτοποίηση και λειτουργική ανάλυση νέων γονιδίων. Στη χρωμαοσωμική περιοχή 10q23.3-25.1 χαρτογραφούνται πολλά μη ταυτοποιημένα και αρκετά σχετιζόμενα με γενετικές ασθένειες, γονίδια. Ένα από αυτά είναι το NEURL, το ανθρώπινο ομόλογο του γονιδίου neuralized (neur) της Drosophila, που χαρτογραφείται στη θέση 10q25.1, την περιοχή με τις πιο συχνές χρωμοσωμικές ανωμαλίες σε καρκινικά αστροκυττώματα. Το neur της Drosophila όπως και τα γονίδια Notch (N), Delta (Dl), Enhancer of split [E(spl)], big brain (bib), mastermind (mam) και almondex (amx), ανήκει στα νευρογόνα γονίδια. Εκφράζεται σε πληθώρα ιστών σε πολλά αναπτυξιακά στάδια και συμμετέχει σε διαδικασίες διακυτταρικής επικοινωνίας, όπου κύριος ρυθμιστής είναι ο διαμεμβρανικός υποδοχέας Notch. Με βάση τα χαρακτηριστικά του δροσοφιλικού neur, διατυπώθηκε η υπόθεση ότι το ομόλογο γονίδιο του ανθρώπου, NEURL, πιθανόν να εμπλέκεται στις διαδικασίες καθορισμού της κυτταρικής τύχης στο νευρικό σύστημα και ότι η απενεργοποίηση του σχετίζεται με την δημιουργία καρκινικών νευροεκτοδερμικών όγκων. Προκειμένου να διευκολυνθεί η λειτουργική διερεύνηση του neuralized στα θηλαστικά, απομονώσαμε και μελετήσαμε το ομόλογο γονίδιο στον ποντικό, Neurl. Λόγω της περιορισμένης πληροφορίας που υπήρχε σχετικά με τη λειτουργία της δροσοφιλικής πρωτείνης Neur, αλλά και για να εκμεταλλευτούμε το πρόσφορο λειτουργικό σύστημα της Drosophila, θεωρήσαμε σκόπιμο να μελετήσουμε παράλληλα και τα δύο γονίδια neur και Neurl, ώστε η διαλεύκανση της λειτουργίας του neur να αξιοποιηθεί για τη διερεύνηση της λειτουργίας του γονιδίου των θηλαστικών. Οι πρωτείνες Neuralized του ποντικού και της Drosophila, έχουν συντηρημένη αρχιτεκτονική δομή καθ' όλο το μήκος των μορίων τους. Τα κύρια κοινά χαρακτηριστικά των πρωτεϊνών αποτελούν δύο επαναλαμβανόμενες περιοχές, NEUZ1 και NEUZ2, άγνωστης λειτουργίας και ο δάκτυλος ψευδαργύρου RING, που αποτελεί χαρακτηριστική δομική περιοχή λιγάσης ουβικουϊτίνης Ε3. Πειράματα προσδιορισμού του προτύπου έκφρασης έδειξαν ότι το γονίδιο Neurl είναι ενεργό από τα αρχικά στάδια της εμβρυογένεσης του ποντικού, στο νευρικό και στηρικτικό σύστημα, στα αναπτυσσόμενα άκρα και στα επιθήλια των εσωτερικών και αισθητηρίων οργάνων. Παροδική έκφραση χιμαιρικών πολυπεπτιδίων Neur ή Neurl, αποτελούμενων από την πράσινη φθορίζουσα πρωτεΐνη (GFP) συνδυασμένη με ολόκληρα μόρια ή υποπεριοχές τους, σε κυτταρικές σειρές θηλαστικών καθώς και πειράματα κατευθυνόμενης υπερέκφρασης στη Drosophila, έδειξαν ότι οι πρωτεΐνες ανιχνεύονται στην κυτταρική μεμβράνη και πιθανότατα σε ενδοκυττωτικά κυστίδια. Από το συνδυασμό βιοχημικών και ανοσο-ιστοχημικών μεθόδων, επίσης, διαπιστώθηκε ότι η σύνδεση των μορίων Neuralized στη μεμβράνη του κυττάρου και στα κυστίδια δεν είναι άμεση αλλά οφείλεται σε αλληλεπιδράσεις με διαμεμβρανικές πρωτεΐνες ή άλλους παράγοντες της κυτταροπλασματικής περιφέρειας. Για την σωστή υποκυτταρική τοποθέτηση των πρωτεΐνών Neurl ή Neur, είναι ικανό και αναγκαίο ένα τμήμα της πρωτεΐνης που εκτείνεται από το αμινοτελικό άκρο μέχρι την περιοχή NEUZ1. Η λειτουργική συγγένεια των πρωτεϊνών διαπιστώθηκε με επιπρόσθετα πειράματα στο σύστημα -μοντέλο της Drosophila. Κατευθυνόμενη υπερέκφραση του διαγονιδίου neur ή Neurl είχε παρόμοια φαινοτυπικά αποτελέσματα σε ενήλικα άτομα. Παρατηρήθηκε διακοπή του ορίου του φτερού και πάχυνση των φλεβών, φαινότυποι που χαρακτηρίζουν την απώλεια λειτουργίας του σηματοδοτικού μηχανισμού Notch. Επίσης παρατηρήθηκε καταστολή της έκφρασης του γονιδίου E(spl)m8, ενός μεταγραφικού στόχου του Notch. Όπως ήταν αναμενόμενο λόγω της εξελικτικής απόστασης, η επίδραση του θηλαστικού πολυπεπτιδίου στο μονοπάτι Notch ήταν μικρότερης έντασης. Αναλυτικότερη λειτουργική μελέτη της πρωτεΐνης της Drosophila έδειξε ότι παίζει σημαντικό ρόλο τόσο στην ενίσχυση της ικανότητας του δεσμευτή Delta (Dl) να ενεργοποιεί τον υποδοχέα Notch (N) όσο και στην μετέπειτα ενδοκύττωση, in cis, και αποικοδόμηση του πρώτου. Επιπλέον, δείχθηκε ότι το Dl συμπαρασύρει σε ενδοκύττωση και την εξωκυττάρια περιχή του Notch (NEC) . Ακόμη, παρατηρήθηκε ότι ο δάκτυλος RING είναι υπεύθυνος για την ενδοκυτταρική μεταφορά του συμπλέγματος Dl- NEC. Αντίθετα, Αυτή η περιοχή δεν συμμετέχει στην ενίσχυση της επαγωγικής ικανότητας του δεσμευτή Delta. Τα παραπάνω αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι η πρωτεΐνη Neuralized παίζει σημαντικό ρόλο στις διαδικασίες διαφοροποίησης λειτουργικά ισοδύναμων κυττάρων και στην υιοθέτηση της διαφορετικής αναπτυξιακής τους πορείας.
|
Δομική και λειτουργική ανάλυση των γονιδίων neuralized του ποντικού και της Drosophila και διερεύνηση, in vivo, του ρόλου τους στη σηματοδότηση Notch
