| Περίληψη |
Ο μετασχηματίζων αυξητικός παράγοντας β (TGF-β) αποτελεί
μέλος μιας μεγάλης υπερ-οικογένειας κυτοκινών που ελέγχουν βιολογικές
διαδικασίες όπως τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό, τη διαφοροποίηση, την
απόπτωση, την επούλωση πληγών, την ανοσολογική απόκριση και τη
φλεγμονή. Ο TGF-β ρυθμίζει τη μεταγραφή πληθώρας γονιδίων μέσω
ενεργοποίησης των κυτταροπλασματικών πρωτεϊνών Smad. Τα βασικά
χαρακτηριστικά λειτουργίας των Smad περιλαμβάνουν τη φωσφορυλίωση
τους έπειτα από ενεργοποίηση του TGF-β μονοπατιού, ομο- και ετερο-
ολιγομερισμό, μετάβαση στον πυρήνα και επαγωγή της μεταγραφής των
γονιδίων-στόχων σε συνεργασία με πυρηνικούς παράγοντες.
Η πρόσφατη ανάλυση δομής-λειτουργίας της ανθρώπινης Smad3
πρωτεΐνης από το εργαστήριο μας, ενός βασικού μεσολαβητή της
σηματοδότησης του TGF-β σε κύτταρα θηλαστικών, ανέδειξε τη μεσαία,
μη-συντηρημένη περιοχή του linker να διαθέτει ισχυρή και ανεξάρτητη
ικανότητα μεταγραφικής ενεργοποίησης. Η περιοχή 200-230 του linker
ήταν η ελάχιστα απαιτούμενη για την ενεργοποίηση και μια μεταλλαγμένη
μορφή της πρωτεΐνης που δε διέθετε την περιοχή 200-230 εμφάνισε
έντονα προβλήματα στον ολιγομερισμό και τη μεταγραφική ενεργοποίηση
υποκινητών-στόχων.
Κατά την παρούσα μελέτη χαρακτηρίσαμε περαιτέρω τη
μεταγραφικά ενεργό περιοχή 200-230 της Smad3 και του ρόλου της στη
σηματοδότηση του TGF-β. Ανάλυση της αμινοξικής αλληλουχίας της
περιοχής ανέδειξε δύο μόνο αμινοξέα (γλουταμίνη 222 και προλίνη 229)
να εμφανίζουν απόλυτη συντήρηση μεταξύ όλων των R-Smads και της
Smad4. Υποθέσαμε, ότι ο υψηλός βαθμός συντήρησης στα δύο αυτά
αμινοξέα είναι ενδεικτικός της σημασίας τους για τη λειτουργία της Smad3.
Για το λόγο αυτό, κατασκεύασαμε μεταλλάγματα της Smad3, τα οποία
έφεραν αλλαγές μόνο στις συγκεκριμένες θέσεις (Smad3 Q222A και
P229A), καθώς και ένα μετάλλαγμα της Smad3 με αλλαγή σε ένα μη
συντηρημένο αμινοξύ (Ν218Α) ως μεταλλαγή ελέγχου. Τα μεταλλαγμένα
Smad3 cDNAs κλωνοποιήθηκαν σε σύντηξη με τους επιτόπους 6-myc και bio, καθώς και με την επικράτεια πρόσδεσης στο DNA του μεταγραφικού παράγοντα GAL4.
Πραγματοποιώντας πειράματα πρωτεϊνικών αλληλεπιδράσεων
βασιζόμενα στη βιοτινυλίωση πρωτεϊνών που φέρουν τον επίτοπο bio in vivo, δείξαμε, ότι η μεταλλαγή στο συντηρημένο αμινοξύ Q222 κατέστειλε
τον ομο- και ετερο-ολιγομερισμό, ενώ η μεταλλαγή στο συντηρημένο
αμινοξύ P229 κατέστειλε την αλληλεπίδραση με την αγρίου τύπου Smad3,
αλλά όχι με τις Smad2 και Smad4. Η μεταλλαγή στο μη συντηρημένο
αμινοξύ Ν218 δεν επηρέασε την ικανότητα ολιγομερισμού της Smad3.
Επίσης, όλες οι μεταλλαγμένες μορφές της Smad3 ήταν ικανές να
αλληλεπιδράσουν in vivo με το συγκαταστολέα c-ski, ο οποίος είναι
γνωστό, ότι αλληλεπιδρά με την επικράτεια MH2.
Σε πειράματα μεταγραφικής ενεργοποίησης δείξαμε, ότι τα
μεταλλάγματα Smad3 Q222A και P229A εμφάνισαν έντονα μειωμένη
ικανότητα μεταγραφικής ενεργοποίησης τεχνητών και φυσικών
υποκινητών συγκριτικά με την αγρίου τύπου Smad3. Η μειωμένη
μεταγραφική ενεργότητα των δύο μεταλλαγμάτων δεν ανεστράφη από την
παρουσία της ακετυλο-τρανσφεράσης των ιστονών p/CAF. Αντίθετα, η
Smad3 N218A συμπεριφέρθηκε παρόμοια με την αγρίου τύπου πρωτεΐνη
τόσο στα πειράματα μεταγραφικής ενεργοποίησης όσο και σε αυτά της
μεταγραφικής συνενεργοποίησης με τον p/CAF.
Τέλος, με πειράματα ανοσοφθορισμού διαπιστώσαμε, ότι η
μεταλλαγή των συντηρημένων αμινοξέων Q222 και P229, αλλά όχι του μη
συντηρημένου Ν218 μείωσε τον πυρηνικό εντοπισμό της αντίστοιχης
μεταλλαγμένης Smad3 πρωτεΐνης.
Βάσει των δεδομένων μας, η μέχρι πρόσφατα μη χαρακτηρισμένη
μεσαία περιοχή του linker της Smad3 εμφανίζεται να παίζει σημαντικό
ρόλο στις κυτταροπλασματικές και πυρηνικές λειτουργίες της Smad3,
όπως τον ολιγομερισμό, τη μετάβαση στον πυρήνα και τη μεταγραφική
ενεργοποίηση των γονιδίων-στόχων του μονοπατιού του TGF-β.
|
Ο ρόλος της περιοχής του linker στη λειτουργία της ανθρώπινης πρωτεΐνης SMAD3, που δρα στο μονοπάτι του TGF-β
