Περίληψη |
Στο εργαστηριό μας ερευνάμε
την επίδραση της οργάνωσης της χρωματίνης και των
επιγενετικών τροποποιήσεων στην ανάπτυξη
κυτταρικών γενεαλογιών του
ανοσοποιητικού συστήματος του ποντικού.
Μια από τις
σημαντικότερες δομές για τη
χρωμοσωματική
αρχιτεκτονική
είναι
το πυρηνικό ικρίωμα,
πάνω στο οποίο
προσδένονται περιοχές του
DNA
γνωστές ως
matrix
attachment
regions
(MARs)
σχηματίζοντας
βρόχους
με τη βοήθεια
πρωτεϊνών.
Η
πρωτεΐνη
special
AT-rich
sequence-binding
protein
1 (SATB1), η οποία
εκφράζεται
κυρίως
στα Τ
λεμφοκύτταρα,
έχει σημαντική δράση στην οργάνωση της χρωματίνης,
καθώς και
στη
ρύθμιση της
μεταγραφής
γονιδίων. Η
SATB1
προσδένεται
σε
MARs
όπου
η
αλληλουχία της
μιας
αλυσίδα έχει μόνο
A,
T,
C
νουκλεοτίδια και είναι επιρρεπής
στο
ξετύλιγμα
της
διπλής έλικας κάτω από
υπερελίκωση.
Επιπλέον,
μεταλλαγές
στη
SATB1
σχετίζονται με αυτοανοσίες και καρκίνους.
Από την άλλη μεριά,
οι
τροποποιήσεις των ιστονών αποτελούν ένα σημαντικό μηχανισμό ρύθμισης της
μεταγραφής.
Οι μόνο-, δι-
και τρι-μεθυλιώσεις
στη
λυσίνης 4 της ιστόνης 3
(H3K4me1/2/3)
έχουν
συσχετιστεί
με
ενεργά εκφραζόμενα
γονίδια. Τόσο στα
ποντίκια, όσο και στον άνθρωπο τις τροποποιήσεις των ιστονών
H3K4me1/2/3
πραγματοποιούν οι
πρωτεΐνες
SET1A/B
και
MLL1/2/3/4 μέσω του συμπλόκου
COMPASS
και
COMPASS-like
αντίστοιχα.
Στο εργαστήριό μας σε προηγούμενα
πειράματα
έγινε ανοσοκατακρήμνιση
και ανάλυση με
φασματομετρία μάζας (IP-MS)
σε
θυμοκύτταρα ποντικών
για να εντοπιστεί το πρωτεΐνωμα της
SATB1. Τα
αποτελέσματα των πειραμάτων
έδειξαν
μεταξύ άλλων
την αλληλεπίδραση
της
SATB1
με το σύμπλοκο
COMPASS
και
COMPASS-like.
Έτσι διατυπώθηκε η
υπόθεση ότι η
SATB1
αλληλεπιδρά
και οδηγεί το σύμπλοκο
COMPASS
σε
συγκεκριμένες περιοχές
του γονιδιώματος, ώστε να μεθυλιώσει την ιστόνη
H3K4 και να επάγει τη μεταγραφή συγκεκριμένων γονιδίων.
Εδώ ελέγχουμε
την
αλληλεπίδραση της
SATB1
με την
SET1A
σε θυμοκύτταρα ποντικών, αρχικά μέσω
διπλής χρώσης
ανοσοφθορισμού,
και
στη συνέχεια
με
πειράματα
συν-ανοσοκατακρήμνισης
μαζί
με στύπωμα
κατά
Western
(co-IP-WB).
Επιπλέον,
για να
ελέγξουμε τις αλλαγές στο πρότυπο μεθυλίωσης
της H3K4,
παρουσία και απουσία
της
SATB1,
γίνανε πειράματα
ανοσοκατακρήμνισης χρωματίνης μαζί με
αλληλούχιση
(ChIP-Seq) για την τροποποίηση της ιστόνης
H3K4me2 σε
C57BL/6
και
CD4.Cre-Satb1fl/fl
θυμοκύτταρα. Τέλος
δημιούργησα
μια
διαδικτυακή αυτοματοποιημένη ροή εργασιών που μπορεί να αναλύει
ακατέργαστα
ChIP-Seq δεδομένα.
|