| Περίληψη |
Τα αυτοάνοσα νοσήματα προκαλούνται από απαντήσεις του ανοσοποιητικού
συστήματος έναντι αυτοαντιγόνων που οδηγούν σε χρόνια ιστική βλάβη. Ένα ιδιαίτερο
χαρακτηριστικό των αυτοάνοσων νοσημάτων είναι ότι εμφανίζονται σε πολύ
μεγαλύτερη συχνότητα στις γυναίκες συγκριτικά με τους άντρες. Ειδικά στην περίπτωση
του Συστηματικού Ερυθηματώδη Λύκου (ΣΕΛ), η αναλογία γυναίκες: άντρες κυμαίνεται
μεταξύ 7:1 έως και 10:1. Από την άλλη, οι άντρες, παρόλο που προσβάλλονται λιγότερο
συχνά, παρουσιάζουν πιο σοβαρές εκδηλώσεις της ασθένειας καθώς και αυξημένα
επίπεδα μη-αναστρέψιμης βλάβης οργάνων (για παράδειγμα από τους νεφρούς).
Συνεπώς, το ΣΕΛ αποτελεί κατάλληλο μοντέλο νόσου για την μελέτη της μοριακής
βάσης του φυλετικού διμορφισμού στην ανθρώπινη αυτοανοσία.
Η ανάλυση της έκφρασης γονιδίων σε ολόκληρο το γονιδίωμα (genome-wide
transcriptomics) αποτελεί μια αμερόληπτη μέθοδο για τη μελέτη πολύπλοκων
νοσημάτων και μοριακών μηχανισμών που εμπλέκονται στην παθογένεια τους.
Πρόσφατα, πραγματοποιήθηκε στο εργαστήριό μας RNA-sequencing σε ολικό αίμα
από 148 ασθενείς με ΣΕΛ και 52 υγιείς εθελοντές. Μετά από βιοπληροφορική ανάλυση
καταλήξαμε σε μια φύλο-εξαρτώμενη γονιδιακή «υπογραφή» (gene signature), η οποία
εντοπίζεται στη νόσο αλλά όχι στους υγιείς εθελοντές. Μεταξύ αυτών των γονιδίων, το
SMC1A, το οποίο κωδικοποιεί για την πρωτεΐνη Structural Maintenance of
Chromosomes 1A, είχε την στατιστικά σημαντικότερη διαφορά ανάμεσα στις γυναίκες
και τους άνδρες ασθενείς. Πιο συγκεκριμένα, οι γυναίκες ασθενείς με ΣΕΛ είχαν
σημαντικά αυξημένα επίπεδα έκφρασης του γονιδίου SMC1A συγκριτικά με τους
άνδρες ασθενείς. Αναζητώντας τον κυτταρικό πληθυσμό του ανοσοποιητικού που
αντικατοπτρίζει καλύτερα την φύλο-εξαρτώμενη έκφραση του γονιδίου SMC1A στο
ΣΕΛ, απομονώσαμε από ολικό αίμα νέας ομάδας ασθενών ΣΕΛ και υγιών εθελοντών
τους 4 κύριους κυτταρικούς υπό-πληθυσμούς του ανοσοποιητικού, δηλαδή τα CD4+ T-
λεμφοκύτταρα, τα CD19 + B-λεμφοκύτταρα, τα CD14 + μονοκύτταρα και τα ουδετερόφιλα
και μελετήσαμε την έκφραση του SMC1A (μεταγραφικά και πρωτεϊνικά) με πειράματα
αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης (RT-PCR) καθώς και ανοσοαποτύπωσης
(Western blot). Μεταξύ των κυτταρικών τύπων που μελετήσαμε, τα CD14 + μονοκύτταρα
είχαν την σημαντικότερη φύλο-εξαρτώμενη έκφραση του SMC1A στο ΣΕΛ συγκριτικά
με την υγιή κατάσταση.
πρωτεΐνη SMC1A αποτελεί βασικό δομικό συστατικό του συμπλέγματος της
κοχεσίνης (cohesin complex) και διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στη ρύθμιση της
γονιδιακής έκφρασης μέσω της προεκβολής βρόχων στο DNA και τη δημιουργία
σχετιζόμενων μεταγραφικά περιοχών (TADs: topologically associating domains). Αξίζει
να σημειωθεί ότι το γονίδιο SMC1A εντοπίζεται στο χρωμόσωμα X και πειραματικά
δεδομένα υποστηρίζουν ότι διαφεύγει εν μέρει από την φυσιολογική αποσιώπησή του.
Με βάση τα παραπάνω, θελήσαμε να εξετάσουμε τον πιθανό ρόλο του SMC1A/
συμπλέγματος κοχεσίνης στην παθογένεια και τον φυλετικό διμορφισμό της
αυτοανοσίας χρησιμοποιώντας το ΣΕΛ ως πρότυπο νόσου.
Για τον σκοπό αυτό, πραγματοποιήσαμε πειράματα ανοσοκατακρήμνισης της
χρωματίνης σε συνδυασμό με αλληλούχιση επόμενης γενιάς (ChIP sequencing) καθώς
και αναλύσεις του μεταγραφώματος σε ενεργοποιημένα μονοκύτταρα που
προσομοιάζουν τα μονοκύτταρα ασθενών ΣΕΛ (μονοκύτταρα τύπου ΣΕΛ). Τα
αποτελέσματα των πειραμάτων έδειξαν ότι οι θέσεις πρόσδεσης της πρωτεΐνης SMC1A
στην χρωματίνη των μονοκυττάρων τύπου ΣΕΛ αλλάζουν δραματικά και η πρωτεΐνη
SMC1A αποκτάει επιλεκτικά πρόσδεση στους ενισχυτές σημαντικών γονιδίων
φλεγμονής, που συμμετέχουν σε μονοπάτια αυτοανοσίας, όπως η έκκριση
κυτταροκινών και η ενεργοποίηση των Τ-λεμφοκυττάρων. Η πρόσδεση της πρωτεΐνης
SMC1A στους ενισχυτές συνοδευόταν από την μεταγραφική έκφραση αυτών των
γονιδίων. Επιπλέον, πειράματα γονιδιακής αποσιώπησης έδειξαν ότι τα μονοκύτταρα
τύπου ΣΕΛ που έχουν ελαττωμένη έκφραση του SMC1A εμφανίζουν μειωμένα επίπεδα
έκφρασης και παραγωγής σημαντικών φλεγμονωδών πρωτεϊνών, όπως είναι η
ιντερλευκίνη 6 (IL-6) και η ιντερλευκίνη 1A (IL-1A), επιβεβαιώνοντας τον ρόλο της
πρωτεΐνης SMC1A να ρυθμίζει γονίδια-κλειδιά στην παθογένεια του ΣΕΛ. Μελετώντας
στην συνέχεια τον ρόλο της πρωτεΐνης SMC1A στον φυλετικό διμορφισμό του ΣΕΛ με
πειράματα ανάλυσης μεταγραφώματος (Quant-seq) μονοκυττάρων που απομονώσαμε
από νέα ομάδα ανδρών και γυναικών ασθενών με ΣΕΛ, διαπιστώσαμε ότι βασικά
γονίδια φλεγμονής, τα οποία βρήκαμε ότι ρυθμίζονται από την SMC1A μέσω
πρόσδεσης στις ρυθμιστικές περιοχές τους, εμφανίζουν μεγαλύτερα επίπεδα έκφρασης
στις γυναίκες συγκριτικά με τους άνδρες ασθενείς με ΣΕΛ. Παράλληλα, με πειράματα
ανοσοκατακρήμνισης της χρωματίνης σε μονοκύτταρα τύπου ΣΕΛ ανδρών και
γυναικών εθελοντών, διαπιστώσαμε ότι η έκφραση καθώς και η πρόσδεση της
πρωτεΐνης SMC1A είναι αυξημένη στους ενισχυτές των γονιδίων IL-6 και IL-1A στις12
γυναίκες συγκριτικά με τους άνδρες. Όλα τα παραπάνω αποτελέσματα υποστηρίζουν
την σύνδεση της πρωτεΐνης SMC1A με τον φυλετικό διμορφισμό στο ΣΕΛ μέσω
ρύθμισης της έκφρασης γονιδίων φλεγμονής καθιστώντας τα μονοκύτταρα των
γυναικών ασθενών ΣΕΛ πιο ευαίσθητα σε φλεγμονώδη ερεθίσματα και συνεπώς τις
γυναίκες πιο επιρρεπείς στην αυτοανοσία. Η διαλεύκανση των μοριακών μηχανισμών
που ευθύνονται για τον φυλετικό διμορφισμό στα αυτοάνοσα νοσήματα είναι
απαραίτητη για να κατανοήσουμε καλύτερα την παθογένειά τους, με απώτερο σκοπό
την ανάπτυξη νέων/καινοτόμων ή εξατομικευμένων (με βάση το φύλο) θεραπειών.
Προκειμένου να μελετήσουμε περαιτέρω την μοριακή βάση του φυλετικού διμορφισμού
στην αυτοανοσία, πραγματοποιήσαμε εκτενή ανάλυση των φύλο-εξαρτώμενων
συμβάντων εναλλακτικού ματίσματος (alternative splicing events) στο ολικό αίμα της
ίδιας κοορτής ασθενών με ΣΕΛ και υγιών εθελοντών που έγινε η μελέτη του
μεταγραφώματος. Από την ανάλυση, προέκυψε ένας μεγάλος αριθμός φύλο-
εξαρτώμενων συμβάντων εναλλακτικού ματίσματος τόσο στους ασθενείς με ΣΕΛ
(ν=428) όσο και στους υγιείς (ν=459). Ωστόσο, τα γονίδια στα οποία αντιστοιχούν τα
φύλο-εξαρτώμενα συμβάντα εναλλακτικού ματίσματος συμμετείχαν σε διαφορετικά
μοριακά μονοπάτια στους ασθενείς με ΣΕΛ συγκριτικά με τους υγιείς. Επιπλέον, τα
φύλο-εξαρτώμενα συμβάντα που εμφανίζονταν αποκλειστικά στους ασθενείς με ΣΕΛ
αντιστοιχούν σε γονίδια τα οποία συμμετέχουν σε δυναμικές λειτουργίες του κυττάρου,
όπως είναι η αναδιαμόρφωση της χρωματίνης, και η απόκριση σε στρες ή φλεγμονή.
Το παρόν εύρημα είναι συναφές με τα προηγούμενα αποτελέσματα σχετικά με την
φύλο-εξαρτώμενη έκφραση της πρωτεΐνης SMC1A που ανήκει στο σύμπλεγμα
κοχεσίνης και το οποίο είναι γνωστό πως διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στην
αναδιαμόρφωση της χρωματίνης. Συνολικά, η ανάλυση ανέδειξε ένα σημαντικό αριθμό
φύλο-εξαρτώμενων συμβάντων εναλλακτικού ματίσματος στους ασθενείς και στους
υγιείς, η λεπτομερής μελέτη των οποίων θα μπορούσε να οδηγήσει στην βαθύτερη
κατανόηση των μοριακών μηχανισμών που διέπουν τον φυλετικό διμορφισμό της
αυτοανοσίας.
Τέλος, διερευνήσαμε την εμφάνιση Προϊούσας Πολυεστιακής Λευκοεγκεφαλοπάθειας
(PML) σε νεαρή γυναίκα ασθενή με ΣΕΛ με ήπια θεραπεία παρουσιάζοντας τις
διαγνωστικές και θεραπευτικές προκλήσεις που σχετίζονται με την συγκεκριμένη
επιπλοκή. Η PML αποτελεί μια σοβαρή, απομυελινωτική νόσο του κεντρικού νευρικού
συστήματος, η οποία προκαλείται από τον ευρύτατα διαδεδομένο ιό πολυώμα John Cunningham (JCV) σε ασθενείς με μειωμένη ανοσιακή απόκριση. Προσπαθώντας να
διαλευκάνουμε τους παράγοντες κινδύνου που συνδέονται με την PML στους ασθενείς
με ΣΕΛ, πραγματοποιήσαμε ανάλυση του ανοσοφαινότυπου στο ολικό αίμα της
ασθενούς καθώς και μελέτη γονιδιακών μεταλλάξεων με whole-exome sequencing. Οι
αναλύσεις έδειξαν σημαντική Β-λεμφοπενία καθώς και επιβλαβείς γονιδιακές
μεταλλάξεις στα γονίδια GATA2 και CDH7, υποδεικνύοντας ότι ενδογενείς παράγοντες
της ασθενούς και όχι η ανοσοκατασταλτική θεραπεία, μπορεί να ευθύνονται για την
επανενεργοποίηση του ιού και την εμφάνιση PML σε μια ομάδα ασθενών με ΣΕΛ.
|
Διερεύνηση της μοριακής βάσης του φυλετικού διμορφισμού στην ανθρώπινη αυτοανοσία
