Your browser does not support JavaScript!

Αρχική    Ο ρόλος των μυοϊνοβλαστών στην ινωτική διεργασία στη νόσο του Crohn  

Αποτελέσματα - Λεπτομέρειες

Προσθήκη στο καλάθι
[Προσθήκη στο καλάθι]
Κωδικός Πόρου 000378997
Τίτλος Ο ρόλος των μυοϊνοβλαστών στην ινωτική διεργασία στη νόσο του Crohn
Άλλος τίτλος The role of myofibroblasts in the fibrotic process in Crohn's disease
Συγγραφέας Δρυγιαννάκης, Ιωάννης Α
Σύμβουλος διατριβής Κουρούμαλης, Ηλίας
Μέλος κριτικής επιτροπής Κολιός, Γεώργιος
Καρδάσης, Δημήτριος
Θερμού, Κυριακή
Παπαδάκης, Κωνσταντίνος
Κουτρουμπάκης, Ιωάννης
Νότας, Γεώργιος
Περίληψη Εισαγωγή Οι εντερικοί υποεπιθηλιακοί μυοϊνοβλάστες (subepithelial myofibroblasts- SEMFs) είναι μεσεγχυματικά κύτταρα θετικά για α-ακτίνης λείων μυϊκών ινών (α-smooth muscle actin- α-SMA) που βρίσκονται στο σημείο επαφής του εντερικού επιθηλίου και του ίδιου χιτώνα (lamina propria). Ινίδια συνδετικού ιστού σχηματίζουν ένα διακριτό φραγμό που ονομάζεται βασική μεμβράνη, μέσω των οποίων οι SEMFs και το επιθήλιο μπορούν να αλληλεπιδρούν με διαλυτούς παράγοντες και εκτείνοντας ψευδοπόδια. Αρχικά στοιχεία έδειξαν ότι οι SEMFs συμμετέχουν στην επούλωση των πληγών και την επακόλουθη ιστική αναδιαμόρφωση του εντέρου, συμπεριλαμβανόμενης και της επιπλοκής της ίνωσης. Ο βλεννογόνος που υπέρκειται των στενώσεων στη νόσο του Crohn (Crohn’s Disease- CD) υπερεκφράζει mRNA των προϊνωτικών TGF-β και του ιστικού αναστολέα των μεταλλοπρωτεασών-1 (tissue inhibitor of metalloproteinases- ΤΙΜΡ-1), ενώ τα τοπικά μεσεγχυματικά κύτταρα υπερπαράγουν κολλαγόνο Ι και ΙΙΙ. Πρώιμες ανοσοϊστοχημικές μελέτες έδειξαν ότι, πλην των φλεγμονωδών κυττάρων του ίδιου χιτώνα (lamina propria), τα επιθηλιακά κύτταρα του εντέρου παρουσιάζουν επίσης έντονη ανοσοδραστικότητα για TGF-β1 στη φλεγμονή λόγω CD. Αυξητικοί παράγοντες, συμπεριλαμβανόμενου του TGF-β, επιτάχυναν τη μετανάστευση των εντερικών μυοϊνοβλαστών του ίδιου χιτώνα (lamina propria), αλλά η παραγωγή του δεν βασιζόταν σε αυτοκρινείς βρόχους. Συνεπώς, φαίνεται ότι η επικοινωνία μεταξύ SEMFs και άλλων τύπων κυττάρων είναι απαραίτητη στη διαδικασία επούλωσης των πληγών και τα γειτονικά επιθηλιακά κύτταρα είναι πιθανοί υποψήφιοι. Μεταλλοπρωτεάσες της εξωκυττάριας ουσίας (matrix metalloproteinases- MMPs) έχουν εμπλακεί στην αναδιαμόρφωση των ιστών και στην εξέλκωση σε ιδιοπαθή φλεγμονώδη εντεροπάθεια (inflammatory bowel disease- IBD) και πολλές MMPs υπερεκφράζονται σε φλεγμαίνοντα εντερικό ιστό από IBD και σε αντίστοιχα ζωικά μοντέλα. Η σημασία της MMP-9 στην εξέλκωση του φλεγμαίνοντος εντέρου επιβεβαιώθηκε σε μελέτες πειραματικής κολίτιδος με νατριούχο θειϊκή δεξτράνη, όπου η έκταση και η σοβαρότητα της βλάβης του εντερικού επιθηλίου ήταν σημαντικά μειωμένη σε ποντίκια που δεν διέθεταν το γονίδιο της MMP-9. Σε αρχικές ανοσοϊστοχημικές μελέτες τα ουδετερόφιλα προσδιορίστηκαν ως η μόνη πηγή της MMP-9 στο φλεγμαίνον έντερο, παρά τον εντοπισμό ανοσοδραστικότητας MMP-9 και στο συνδετικό ιστό που γειτνιάζει με τις κρύπτες, γεγονός που προτείνει την πιθανή εμπλοκή των SEMFs. Τα επιθηλιακά κύτταρα έχει προταθεί ότι ελέγχουν τις εν λόγω διαδικασίες. Υποστηρικτικά στοιχεία προήλθαν από παρατηρήσεις σε άλλους ιστούς, όπως το δέρμα και οι πνεύμονες. Στο δέρμα, τα κερατινοκύτταρα είναι εν μέρει υπεύθυνα για την επαγωγή της α-SMA σε ινοβλάστες μέσω TGF-β και ενδοθηλίνης-1 (endothelin-1, ET-1). Αλληλεπιδράσεις μεταξύ των κερατινοκυττάρων και των υποκείμενων ινοβλαστών, επίσης, φαίνεται να διαφοροποιούν τα επίπεδα δύο βασικών ενζύμων που εμπλέκονται στην αναδιαμόρφωση της εξωκυττάριας ουσίας: MMP-2 και MMP-9. Στους πνεύμονες, υπό συνεχή συμπίεση, τα επιθηλιακά κύτταρα αυξάνουν τη γονιδιακή έκφραση και την έκκριση ΕΤ και TGF-β2. Θρεπτικό μέσο από επιθηλιακά κύτταρα υπό τάση επάγει την ενσωμάτωση της προλίνης σε πρωτεΐνες της εξωκυττάριας ουσίας (κυρίως κολλαγόνο) σε ανθρώπινους ινοβλάστες των πνευμόνων χωρίς αυτοί να βρίσκονται υπό τάση μέσω οδών που εμπλέκουν ΕΤ και TGF-β2. 7.2 Ευρήματα ELISA σε υπερκείμενα 24ώρου των κολονικών επιθηλιακών κυτταροσειρών ΗΤ-29 και CaCO-2 έδειξαν αξιόλογη έκκριση TGF-β1. Η προσθήκη των προφλεγμονωδών κυτταροκινών IL-1α, TNF-α και IFN-γ στα θρεπτικά μέσα κυτταροκαλλιέργειας αύξησε σημαντικά την παραγωγή του TGF-β1 με την IL-1α να αποτελεί το πιο ισχυρό ερέθισμα. Οι συνδυασμοί των κυτταροκινών είχαν αθροιστική δράση, με την παραγωγή TGF-β να είναι μέγιστη όταν στα επιθηλιακά κύτταρα επέδρασαν και οι τρεις κυτταροκίνες. Οι άλλες δύο ισομορφές TGF-β (TGF-β2 και TGF-β3) επίσης εκκρίνονταν από αδιέγερτα επιθηλιακά κύτταρα σε σημαντικές ποσότητες και η παραγωγή τους αυξανόταν υπό την επίδραση προφλεγμονωδών κυτταροκινών με παρόμοιο τρόπο. Πρωτογενείς SEMFs παχέος εντέρου και η αντίστοιχη κυτταροσειρά 18CO έκκριναν πολύ μικρές ποσότητες TGF-β1 και TGF-β3 στις 24 ώρες καλλιέργειας και δεν απαντούσαν σε IL-1α, TNF-α και IFN-γ, μεμονωμένων ή σε κάθε πιθανό συνδυασμό. Δεν μπορέσαμε να ανιχνεύσουμε παραγωγή TGF-β2 σε πρωτογενείς SEMFs ή σε 18CO, ακόμα και μετά από διέγερση με τις τρεις προφλεγμονώδεις κυτταροκίνες, μεμονωμένες ή σε κάθε πιθανό συνδυασμό. Ακόμη, διαπιστώσαμε ότι και οι δύο επιθηλιακές κυτταρικές σειρές εκκρίνουν σημαντικές ποσότητες του ΤΙΜΡ-1, ενός άλλου μεσολαβητή της ίνωσης στο υπερκείμενο κυτταροκαλλιέργειας 24ώρου. Η επίδραση TNF-α και IFN-γ, αλλά όχι IL-1α, αύξησαν σημαντικά την έκκριση ΤΙΜΡ-1 και στις δύο κυτταρικές σειρές. Επίδραση με δύο ή και με τις τρεις κυτταροκίνες περαιτέρω αύξησε την παραγωγή ΤΙΜΡ-1. Πρωτογενείς SEMFs και 18CO επίσης είχαν βασική έκκριση σημαντικών συγκεντρώσεων ΤΙΜΡ-1, αλλά, παραδόξως, δεν απαντούσαν σε διέγερση με IL-1α, TNF-α και IFN-γ, μεμονωμένων ή σε συνδυασμό επί 24 ώρες- ευρήματα παρόμοια με αυτά που αφορούν τον TGF-β. Επιπλέον, εξετάσαμε την παρουσία των gelatinases MMP-2 και MMP-9 στο υπερκείμενο καλλιέργειας SEMFs. Ανιχνεύθηκαν με ζυμογραφία σε υπόστρωμα gelatin ως ζώνες λύσης της gelatin και διαχωρίστηκαν με βάση το μοριακό βάρος τους (MMP-2: 70 kDa, MMP-9: 100 kDa). Πρωτογενείς SEMFs και τα 18CO παρουσίαζαν δραστικότητα MMP-2 στο υπερκείμενο 24ωρης κυτταροκαλλιέργειας χωρίς κανένα επιπλέον ερέθισμα, αλλά αυτό δεν ίσχυε για την MMP-9. Επίδραση σε πρωτογενείς SEMFs και 18CO με TNF-α ή IL-1α για 24h προκαλούσε δραστικότητα MMP-9 στα υπερκείμενα και ο συνδυασμός και των δύο είχε αθροιστική επίδραση. Η IFN-γ δεν είχε καμία επίδραση από μόνη της, αλλά, όταν προσετίθετο σε TNF-α, IL-1α ή το συνδυασμό τους, κατέστελλε τη δραστικότητα MMP-9 στα υπερκείμενα. Ως εκ τούτου, ο συνδυασμός και των τριών προφλεγμονωδών κυτταροκινών (IL-1α+TNF-α+IFN-γ) δεν προκαλούσε σημαντική δραστικότητα MMP-9. Επιπλέον, οι κυτταροκίνες αυτές μεμονωμένα ή σε κάθε δυνατό συνδυασμό δεν είχαν επίδραση στην MMP-2. Υπερκείμενα επιθηλιακών κυττάρων δεν έδειξαν λυτική δραστηριότητα gelatin, παρά τη διέγερση με IL-1α, TNF-α, IFN-γ, μεμονωμένων ή σε συνδυασμό. Στη συνέχεια διερευνήσαμε το αποτέλεσμα υπερκειμένου καλλιεργειών επιθηλιακών κυττάρων σε καλλιέργειες μυοϊνοβλαστών. Μόνο αν καλλιέργειες CaCO-2 προεπωάζονταν για 6 ώρες με IL-1α, TNF-α, IFN-γ, μεμονωμένα ή σε συνδυασμό, επαγόταν δραστικότητα MMP-9 σε SEMFs και 18CO, αλλά με τις κυτταροκίνες αυτές να μην ενεργούν άμεσα στους μυοϊνοβλάστες. Παρόμοια αποτελέσματα ελήφθησαν με την κυτταροσειρά HT-29. Ως εκ τούτου, η παραγωγή MMP-9 στους μυοϊνοβλάστες πυροδοτήθηκε από διαλυτό μεσολαβητή προερχόμενο από επιθηλιακά κύτταρα που εκτέθηκαν στις κυτταροκίνες. Τα αποτελέσματα ήταν ταυτόσημα όταν χρησιμοποιήθηκαν SEMFs από φλεγμαίνοντα μη ινωτικά τμήματα παχέος εντέρου από CD. Ακολούθως, εξετάσαμε αν ο TGF-β ήταν υπεύθυνος για την επαγωγή της MMP-9 στους SEMFs από υπερκείμενο επιθηλιακών προεπωασμένων με προφλεγμονώδεις κυτταροκίνες. Η υπόθεση αυτή βασίστηκε στην παρατήρηση ότι εξωγενής TGF-β1 προκαλούσε επαγωγή δραστικότητας MMP-9 σε πρωτογενείς SEMFs με δοσοεξαρτώμενο τρόπο. Ωστόσο, η εξουδετέρωση όλων των ισομορφών TGF-β δεν επηρέασε σημαντικά την επαγωγή MMP-9 σε SEMFs υπό το προαναφερθέν ερέθισμα. Τα αποτελέσματα ήταν παρόμοια με υπερκείμενο από CaCO-2 ή όταν χρησιμοποιήθηκαν SEMFs από CD ή η κυτταροσειρά 18CO. Στους πνεύμονες, η παραγωγή της ΕΤ-1 από διεγερμένα βρογχικά επιθηλιακά κύτταρα θα μπορούσε να είναι υπεύθυνη για την επαγωγή δραστικότητας MMP-9 από συγκαλλιεργούμενους ινοβλάστες δέρματος. Ως εκ τούτου, θέσαμε το ερώτημα κατά πόσο η επαγωγή της MMP-9 ήταν εξαρτώμενη από ενδοθηλίνες. Δείξαμε ότι η αναστολή του υποδοχέα ενδοθηλινών (ET receptor, ETR)-A σε καλλιέργειες SEMFs εμποδίζει την επαγωγή της MMP-9 από υπερκείμενο προδιεγερμένων επιθηλιακών. Αντιθέτως, η ειδική αναστολή τoυ ETR-Β δεν είχε καμία επίδραση στην επαγόμενη MMP-9. Επιπλέον, δεν υπήρχε επιπλέον επίδραση στην MMP-9, όταν αναστέλλονταν και ο ETR-Α και ο ETR-Β. Το φαινόμενο μπορούσε να αναπαραχθεί σε SEMFs από CD. Διερευνήσαμε περαιτέρω πτυχές της επικοινωνίας μεταξύ των επιθηλιακών κυττάρων και των μυοϊνοβλαστών ως προς την αναδιαμόρφωση του συνδετικού ιστού, όπως η παραγωγή κολλαγόνου. Αρχικά, μετρήσαμε την παραγωγή κολλαγόνου σε μυοϊνοβλάστες απουσία ή παρουσία προφλεγμονωδών κυτταροκινών. Η μέθοδος Sircol χρησιμοποιήθηκε για την ποσοτική αθροιστική μέτρηση των περισσότερων τύπων κολλαγόνου. SEMFs και 18CO είχαν ελάχιστη έκκριση συνολικού κολλαγόνου στα υπερκείμενα των καλλιεργειών σε προκαταρκτικά πειράματα. Κατά συνέπεια, μελετήσαμε τη συνολική παραγωγή κολλαγόνου, μετρώντας το ολικό ενδοκυττάριο κολλαγόνο. Η επίδραση IL-1α, TNF-α και IFN-γ, μόνων, σε ζεύγη ή όλων δεν είχε σημαντική επίδραση στη σύνθεση του κολλαγόνου στις 24 ώρες. Είναι ενδιαφέρον επίσης ότι διέγερση με TGF-β1, έναν προϊνωτικό παράγοντα που σχετίζεται με εντερική ίνωση, επιφέρει μία ελάχιστη, στατιστικά ασήμαντη αύξηση της παραγωγής κολλαγόνου στις 24 ώρες. Βρήκαμε, όμως, ότι SEMFs από CD παρήγαγαν ιδιοσυστασιακά αυξημένο κολλαγόνο ex vivo σε σύγκριση με SEMFs απομονωμένους από ομάδα ελέγχου. Ακολούθως, προχωρήσαμε στη μελέτη της επίδρασης υπερκείμενου επιθηλιακών στην παραγωγή κολλαγόνου από τους μυοϊνοβλάστες και διαπιστώθηκε ότι αυτό αύξησε σημαντικά την παραγωγή κολλαγόνου. Η παρατηρούμενη επίδραση ήταν μέτριας έντασης όταν χρησιμοποιήθηκε θρεπτικό μέσο αδιέγερτων επιθηλιακών. Αντίθετα, όταν χρησιμοποιήθηκε υπερκείμενο προδιεγερμένων με τις τρεις κυτταροκίνες επιθηλιακών, παρατηρήσαμε έντονη αύξηση της παραγωγής κολλαγόνου. Παρόμοια αλλά λιγότερο έντονα ήταν τα αποτελέσματα όταν χρησιμοποιήθηκε η κυτταροσειρά 18CO αντί πρωτογενών SEMFs. Επιχειρήσαμε να εντοπίσουμε τους προερχόμενους από τα επιθηλιακά κύτταρα παράγοντες που ευθύνονταν για την αύξηση της σύνθεσης κολλαγόνου στους SEMFs. Ο TGF-β παράγεται από επιθηλιακά κύτταρα και η παραγωγή του αυξανόταν από τις τρεις κυτταροκίνες. Ως εκ τούτου, ήταν πιθανός υποψήφιος μεσολαβητής. Ωστόσο, η εξουδετέρωση και των τριών μορφών του TGF-β στα ECC δεν επηρέασε την αύξηση της παραγωγής κολλαγόνου σε SEMFs από ομάδα ελέγχου ή CD. Ως εκ τούτου, ο TGF-β δεν ήταν απαραίτητο μηνυματοφόρο μόριο για την επαγωγή της αύξησης της σύνθεσης κολλαγόνου στους SEMFs από υπερκείμενο επιθηλιακών. Προηγούμενες μελέτες έδειξαν ότι η αλληλεπίδραση μεταξύ του ιστικού παράγοντα (tissue factor- TF) και του ενεργού παράγοντα VII της πήξης (factor VII- FVII) επάγει τον προϊνωτικό CTGF σε ανθρώπινα κερατινοκύτταρα. Επιπλέον, στους SEMFs έχει αποδειχθεί η αύξηση της παραγωγής κολλαγόνου με αυτοκρινή τρόπο μέσω έκκρισης CTGF και TF. Εμείς δείξαμε την επαγωγή CTGF σε πρωτογενείς SEMFs υπό την επίδραση υπερκείμενου επιθηλιακών, ειδικά αν τα επιθηλιακά κύτταρα προεπωάζονταν με προφλεγμονώδεις κυτταρροκίνες. Η έκφραση CTGF εξαρτάται από την παρουσία της θρομβίνης και TF, και μειώνεται υπό την επίδραση αντιθρομβίνης ΙΙΙ. Η παραγωγή TF και επακόλουθα κολλαγόνου επίσης εξαρτάται από την σηματοδότησης ΕΤ-1. Έτσι, μελετήσαμε την υπόθεση ότι οι CTGF, TF, θρομβίνη ρυθμίζουν την προϊνωτική σηματοδότηση στο αποτελούμενο από δύο κύτταρα σύστημά μας. Ωστόσο, η εξουδετέρωση του CTGF ή η χρήση αντιθρομβίνης-ΙΙΙ δεν εμπόδισε την αύξηση της παραγωγής κολλαγόνου από SEMFs απομονωμένους από ομάδα ελέγχου ή CD υπό υπερκείμενο διεγερμένων επιθηλιακών. Το ίδιο ήταν αληθές για την εξουδετέρωση του TF σε διεγερμένους όμοια SEMFs από ομάδα ελέγχου. Ανταγωνιστές των υποδοχέων ενδοθηλινών επίσης δεν είχαν καμία επίδραση στην αύξηση της παραγωγής κολλαγόνου σε SEMFs από ομάδα ελέγχου ή CD. Η κινητικότητα/ μετανάστευση των SEMFs εκτιμήθηκε με τη δοκιμασία επούλωσης πληγής και ποσοτικοποιήθηκε ως ποσοστό της επούλωσης in vitro. Η προσθήκη εξωγενούς TGF-β1 σε πρωτογενείς καλλιέργειες SEMFs βρέθηκε να αυξάνει την κινητικότητα/ μετανάστευσης των SEMFs με δοσοεξαρτώμενο τρόπο. Σε αντίθεση, TNF-α και IFN-γ μείωσαν το ρυθμό επούλωσης. Σε συνδυασμό, αυτές οι κυτταροκίνες άσκησαν αθροιστική δράση. Η IL-1α δεν μετέβαλε τη μετανάστευση ούτε μόνη της ούτε όταν χρησιμοποιήθηκε σε συνδυασμό με καθεμία ή και με τις δύο προηγούμενες κυτταροκίνες. Για να μελετήσουμε τις πιθανές επιδράσεις των επιθηλιακών κυττάρων και σε αυτή τη βιολογική διεργασία, χρησιμοποιήσαμε υπερκείμενο επιθηλιακών για να διεγείρουμε πρωτογενείς SEMFs. Όταν αυτό προερχόταν από CaCO-2 στα οποία δεν είχαν επιδράσει προφλεγμονώδεις κυτταροκίνες, ο ρυθμός επούλωσης δεν μεταβαλλόταν. Η κινητικότητα/ μετανάστευση των SEMFs μειώθηκε όταν τα CaCO-2 είχαν προεπωαστεί για 6 ώρες με IL-1α, TNF-α ή IFN-γ, και αυτό επιβράδυνε την επούλωση σημαντικά. Η προεπώαση των επιθηλιακών και με τις τρεις κυτταροκίνες είχε ως αποτέλεσμα ισχυρότερη αναστολή της επούλωσης, παρά την απουσία των αρχικών προφλεγμονωδών ερεθισμάτων. Παρόμοια αποτελέσματα ελήφθησαν όταν χρησιμοποιήθηκε υπερκείμενο HT-29 επί των SEMFs. Διαπιστώθηκε λοιπόν, ότι προφλεγμονώδη ερεθίσματα θα μπορούσαν να αναστείλουν τη μετανάστευση των SEMFs τόσο άμεσα όσο και έμμεσα μέσω των επιθηλιακών κυττάρων μέσω διαλυτού/ών παράγοντα/ων. Επιπλέον, η επίδραση του εντερικού επιθηλίου στην επούλωση των πληγών από τους παρακείμενους SEMFs διέφερε από εκείνη που προβλέπεται από την επαγωγή TGF-β: το τελικό αποτέλεσμα ενδεχομένως διαμορφώνεται και από άλλους παράγοντες πλην του TGF-β που εκκρίνουν τα επιθηλιακά. 7.3 Συμπεράσματα Αυτή η μελέτη παρέχει ενδείξεις δυνητικής επικοινωνίας μεταξύ των εντερικών επιθηλιακών κυττάρων και των SEMFs. In vitro διέγερση των επιθηλιακών με προφλεγμονώδεις κυτταροκίνες, που μερικώς μιμείται την επιθηλιακή βλάβη στην εντερική φλεγμονή, προκάλεσε αλλαγές στους SEMFs παρόμοιες με αυτές που παρατηρούνται στην εντερική ίνωση. Αυτές συμπεριλάμβαναν αύξηση του κολλαγόνου, επαγωγή της MMP-9 που εξαρτιόταν από τον υποδοχέα ενδοθηλινών Α και μείωση της μετανάστευσης. Τα αποτελέσματά μας υποστηρίζουν την περαιτέρω μελέτη και την in vivo επιβεβαίωση της επικοινωνίας μεταξύ επιθηλιακών κυττάρων και παρακείμενων SEMFs στη ρύθμιση της αναμόρφωσης της εξωκυττάριας ουσίας και της ίνωσης που προκαλεί η εντερική φλεγμονή.
Φυσική περιγραφή 408 σ : πιν. ; 23 εκ.
Γλώσσα Ελληνικά, Αγγλικά, Αγγλικά
Θέμα Collagen
Crohn Disease
Endothelin
Inflammatory Bowel Diseases etiology
Intestinal epithelial cell
Intestinal fibrosis
Matrix metalloproteinases
Myofibroblast
Myofibroblast migration
Transforming growth factor
Αυξητικός παράγων μεταμόρφωσης
Ενδοθηλίνη
Εντερική ίνωση
Εντερικό επιθηλιακό κύτταρο
Κολλαγόνο
Μεταλλοπρωτεάσες
Μετανάστευση μυοϊνοβλαστών
Μυοϊνοβλάστης
Νόσος Crohn
Ημερομηνία έκδοσης 2012-07-24
Συλλογή   Σχολή/Τμήμα--Σχολή Επιστημών Υγείας--Τμήμα Ιατρικής--Διδακτορικές διατριβές
  Τύπος Εργασίας--Διδακτορικές διατριβές
Εμφανίσεις 77

Ψηφιακά τεκμήρια
No preview available

Προβολή Εγγράφου
Εμφανίσεις : 6