| Περίληψη |
Υπάρχουν ενδείξεις ότι υπάρχει αντίστροφη σχέση μεταξύ των επιπέδων της HDL χοληστερόλης στο πλάσμα και του κινδύνου ανάπτυξης στεφανιαίας νόσου. Το ερευνητικό ενδιαφέρον εστιάζεται στην αύξηση της έκφρασης γονιδίων που συμμετέχουν στη βιοσύνθεση και το μεταβολισμό της HDL, όπως τα γονίδια απολιποπρωτεϊνών, των μεταφορέων της χοληστερόλης και των ενζύμων αναδιαμόρφωσης της HDL. Όλα αυτά τα γονίδια φαίνεται να ρυθμίζονται από τους πυρηνικούς υποδοχείς ορμονών και κυρίως από τους LXRs (Liver X Receptors). Σ΄ αυτά τα γονίδια ανήκει και ο μεμβρανικός μεταφορέας λιπιδίων ABCA1 ο οποίος παίζει σημαντικό ρόλο στη βιογένεση της HDL, προάγοντας την εκροή χοληστερόλης και φωσφολιπιδίων από τα κύτταρα προς τη φτωχή σε λιπίδια απολιποπρωτεΐνη Α‐Ι. Πρόσφατα αποτελέσματα του εργαστήριου μας έδειξαν ότι ο μεταγραφικός παράγοντας FOXA2, ο οποίος είναι μέλος της οικογένειας forkhead box (FOX) μεταγραφικών παραγόντων, είναι αρνητικός ρυθμιστής της έκφρασης του ABCA1 στα ηπατικά κύτταρα. Προσδένεται στον υποκινητή του γονιδίου ABCA1 και αναστέλλει τη βασική μεταγραφή του ABCA1 καθώς και την ενεργοποίηση του από τις οξυστερόλες μέσω των πυρηνικών υποδοχέων LXRα/RXRα.
Ο σκοπός της παρούσας μεταπτυχιακής εργασίας ήταν η διαλεύκανση του κατασταλτικού μηχανισμού ρύθμισης της μεταγραφής του γονιδίου ABCA1 και παρόμοιας ρύθμισης άλλων γονιδίων του μεταβολισμού της HDL από τον παράγοντα FOXA2 μέσω των πυρηνικών υποδοχέων LXR/RXR.
Με μια σειρά πειραμάτων αλληλεπίδρασης πρωτεϊνών in vitro (GST pull down assays) και ex vivo (Co‐IPs), εξετάστηκε η αλληλεπίδραση του FOXA2 με τον πυρηνικό υποδοχέα LXRα. Διαπιστώθηκε, ότι ο LXRα, μέσω της περιοχής πρόσδεσης στο DNA και ενός τμήματος της Α/Β περιοχής, αλληλεπιδρά με τον παράγοντα FOXA2, προκειμένου ο τελευταίος να αναστείλει την μεταγραφή του γονιδίου του ABCA1. Επιπλέον, αποδείχτηκε ότι ο LXRα αλληλεπιδρά in vitro και ex vivo με ένα άλλο μέλος της οικογένειας των Forkhead παραγόντων, τον FOXΟ1. Το κοινό στοιχείο μεταξύ των FOXA2 και FOXO1 είναι η ρύθμισή τους, μέσω φωσφορυλίωσης, από το μονοπάτι της ινσουλίνης και την κινάση AKT/PKB. Ακόμη, ο παράγοντας FOXA2 αλληλεπιδρά και με άλλους πυρηνικούς υποδοχείς και συγκεκριμένα με τους RARα, HNF4α, LXRβ, FXR, TRβ1 και RXRα. Το εύρημα αυτό σημαίνει ότι ο παράγοντας FOXA2 μπορεί να είναι ένας γενικότερος ρυθμιστής της έκφρασης γονιδίων‐στόχων των πυρηνικών υποδοχέων ορμονών και να εμπλέκεται σε πολλές βιολογικές διεργασίες που εξαρτώνται από τους παράγοντες αυτούς. Σε απόδειξη αυτής της θεωρίας δείξαμε με πειράματα μέτρησης ενεργότητας λουσιφεράσης, ότι ο FOXA2 καταστέλλει την επαγωγή των γονιδίων των απολιποπρωτεϊνών CIII και AI από τον ορφανό πυρηνικό υποδοχέα HNF4α.
Ένας δεύτερος στόχος της παρούσας εργασίας ήταν η κατασκευή πλασμιδιακών φορέων που παράγουν shRNAs για τους πυρηνικούς υποδοχείς LXRα και LXRβ. Ο απώτερος στόχος είναι η ταυτοποίηση γονιδίων που ενεργοποιούνται επιλεκτικά από τον έναν ή τον άλλον υποδοχέα και η αξιοποίησή τους ως εργαλεία για την αύξηση των επιπέδων της HDL στο πλάσμα. Με πειράματα παροδικής διαμόλυνσης κυττάρων που εκφράζουν φορείς έκφρασης για του υποδοχείς LXRα και LXRβ παρουσία ή απουσία των φορέων έκφρασης των shRNAs αποδείξαμε την αποτελεσματικότητα και την εξειδίκευση των shRNAs που σχεδιάσαμε. 7
Συμπερασματικά, οι μελέτες της παρούσης εργασίας σκοπεύουν στο να αυξήσουν τις γνώσεις μας πάνω στους μηχανισμούς ρύθμισης των γονιδίων που εμπλέκονται στον μεταβολισμό της λιποπρωτεΐνης HDL. Η κατανόηση των μηχανισμών αυτών θα οδηγήσει μελλοντικά στη δημιουργία νέων μορίων που θα αυξάνουν τα επίπεδα της HDL, και θα μειώνουν τον κίνδυνο αθηροσκλήρωσης και στεφανιαίας νόσου.
|
Μεταγραφική ρύθμιση γονιδίων που συμμετέχουν στον μεταβολισμό της HDL από πυρηνικούς υποδοχείς ορμονών και μέλη της οικογένειας Forkhead box (FOX)
