| Περίληψη |
Η αυτοφαγία είναι ένας μηχανισμός άμυνας του κυττάρου, ο οποίος ενεργοποιείται σε καταστάσεις πίεσης ή σαν απόκριση σε περιβαλλοντικές ή θρεπτικές αλλαγές. Κατά την διάρκεια της αυτοφαγίας, το κύτταρο ξεφορτώνεται κατεστραμμένα και δυσλειτουργικά οργανίδια ή παθογόνα, τα οποία μέσω αυτής της διαδικασίας, εσωκλείονται σε κυστίδιο με διπλή μεμβράνη, το αυτοφαγόσωμα. Το αυτοφαγόσωμα συντήκεται με το λυσόσωμα με αποτέλεσμα όλο το περιεχόμενο να αποικοδομηθεί και να ανακυκλωθεί και με αυτόν τον τρόπο η όλη διαδικασία συμβάλλει στην επιβίωση του κυττάρου. Η αυτοφαγία είναι μία από τις πολλές κυτταρικές λειτουργίες που ελέγχονται από το PI3K-Akt-mTOR ενδοκυττάριο σηματοδοτικό μονοπάτι που οι βασικές του συνιστώσες είναι οι Αkt κινάσες που μέσω του mTORC1 συμπλόκου καταστέλλουν την αυτοφαγία. Επομένως, υποθέτουμε ότι η απουσία αυτών των κινασών θα πρέπει να οδηγεί σε επαγωγή της αυτοφαγίας. Ο σκοπός της παρούσας εργασίας, ήταν να προσδιορίσουμε την επίδραση της έλλειψης των Akt1 και Akt2 κινασών στην αυτοφαγία των μακροφάγων, υπό την επίδραση διαφορετικών ερεθισμάτων όπως LPS, IL4, IFNγ και ινσουλίνης. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η προσθήκη LPS στα μακροφάγα με έλλειψη είτε στην Akt1 ή στην Akt2 κινάση (Αkt1-/-, Akt2-/- μακροφάγα αντίστοιχα), δεν οδήγησε σε έκφραση του LC3 δείκτη αυτοφαγίας. Η απουσία ορού από το θρεπτικό υλικό των κυττάρων δεν επηρέασε τα επίπεδα του LC3-II στα Raw264.7 κύτταρα και υπήρχε μια μικρή επαγωγή της αυτοφαγίας μετά από 6h και 24h από την προσθήκη IFNγ ή IL4 τόσο στα περιτοναϊκά μακροφάγα όσο και στα Raw. Επιπλέον, η προσθήκη rapamycin, ενός αναστολέα του mTOR, δεν αύξησε τα επίπεδα του LC3 πάνω από τα βασικά επίπεδα. Ποσοτική ανάλυση με αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης πραγματικού χρόνου (real-time PCR) πραγματοποιήθηκε για να εκτιμηθούν τα επίπεδα έκφρασης δύο σημαντικών γονιδίων αυτοφαγίας, των Atg5 και Atg7. Τα αποτελέσματα έδειξαν αύξηση στα επίπεδα και των δύο γονιδίων μετά από 24h από την προσθήκη LPS στα Raw264.7 κύτταρα σε συνθήκες απουσίας ορού από το θρεπτικό. Παρουσία του ορού, η έκφραση του Atg7 μειώθηκε μετά από 6h και 24h από την προσθήκη LPS τόσο στα WT όσο και στα Akt1-/-
~ 6 ~
μακροφάγα, ενώ η έκφραση του Atg5 αυξήθηκε 24h μετά την προσθήκη LPS τόσο στα WT όσο και στα Akt1-/- μακροφάγα. Επιπρόσθετα, η έκφραση και των δυο γονιδίων αυξήθηκε μετά από 6h και 24h από την προσθήκη IFNγ στα Akt1-/- κύτταρα, σε σύγκριση με τα αγρίου τύπου WT, ενώ μόνο τα επίπεδα του Atg7 ήταν υψηλότερα στα Raw κύτταρα μετά από ταυτόχρονη προσθήκη με LPS και IFNγ σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου (untreated). Όσον αφορά τον δείκτη μιτοφαγίας Pink-1, τα επίπεδα έκφρασης του ποίκιλλαν σε απόκριση στα διαφορετικά ερεθίσματα. Συγκεκριμένα, η απουσία του Akt1, οδήγησε σε αυξημένα βασικά επίπεδα μιτοφαγίας. Παρόλο που το LPS κατέστειλε την μιτοφαγία στα WT μακροφάγα, αυτή η καταστολή δεν παρατηρήθηκε στα Akt1-/- μακροφάγα 24h μετά την διέγερση. Στις 48h μετά την προσθήκη LPS και στις συνθήκες απουσίας του ορού από το θρεπτικό, αυτές οι διαφορές δεν παρατηρήθηκαν. Επομένως, μπορούμε να συμπεράνουμε ότι η Akt1 κινάση ελέγχει με διαφορετικό τρόπο την έκφραση των Atg5 και Atg7 γονιδίων στα μακροφάγα και η απουσία είτε της Akt1 ή της Akt2 δεν επηρεάζει την LC3-εξαρτώμενη αυτοφαγία, υποδηλώνοντας έναν πιθανό πλεονασμό μεταξύ των δύο Akt ισομορφών.
|
Contribution of AKT kinases in macrophage autophagy
