| Περίληψη |
Ο μετασχηματίζων αυξητικός παράγοντας β (TGFβ) είναι μια πλειοτροπική κυτταροκίνη η οποία ρυθμίζει πληθώρα βιολογικών διεργασιών όπως ο κυτταρικός πολλαπλασιασμός, η διαφοροποίηση, η αιματοποίηση, η επούλωση πληγών και η απόπτωση. Ο TGFβ είναι μέλος μιας υπεροικογένειας κυτοκινών οι οποίες κωδικοποιούνται από 29 διαφορετικά γονίδια στον άνθρωπο. Η σηματοδότηση από αυτούς τους παράγοντες αρχίζει με πρόσδεση του TGFβ σε συγκεκριμένους διαμεμβρανικούς υποδοχείς με ενεργότητα σερίνης/θρεονίνης, τύπου Ι και τύπου ΙΙ. Ο ρόλος του TGFβ είναι να φέρει σε επαφή αυτές τις δύο κινάσες, σχηματίζοντας ένα ετερομερές σύμπλοκο υποδοχέων και να επιτρέψει την φωσφορυλίωση του τύπου Ι υποδοχέα από τον τύπου ΙΙ υποδοχέα. Στη συνέχεια, ο τύπου Ι υποδοχέας φωσφορυλιώνει τις Smad πρωτεΐνες, οι οποίες με τη σειρά τους σχηματίζουν ολιγομερή και μετατοπίζονται στον πυρήνα όπου ενεργοποιούν την μεταγραφή γονιδίων στόχων του TGFβ σε συνεργασία με πυρηνικούς παράγοντες και συνενεργοποιητές. Το κεντρικό Smad σηματοδοτικό μονοπάτι είναι ενσωματωμένο σε ένα σύμπλοκο θετικών και αρνητικών ρυθμιστών οι οποίοι επηρεάζουν σημαντικά την κυτταρική απόκριση στον TGFβ. Ο σκοπός του πρώτου μέρους της παρούσας διατριβής ήταν η εκπόνηση λειτουργικής χαρτογράφησης της περιοχής του συνδέτη της Smad3 πρωτεΐνης ο οποίος περικλείει μία μεταγραφικά ενεργή περιοχή, η οποία ταυτοποιήθηκε πρόσφατα στο εργαστήριο μας. Απότελέσματα από το εργαστήριο μας έδειξαν πρόσφατα ότι εσωτερική απαλοιφή της περιοχής 200-230 του συνδέτη καταστέλλει την μεταγραφική ικανότητα της Smad3 πρωτεΐνης. Σε πειράματα που περιγράφονται στην παρούσα διατριβή, επωάζοντας κύτταρα με κυκλοεξιμίδη, η οποία αναστέλλει την πρωτεινοσύνθεση, παρατηρήθηκε ότι η παραπάνω εσωτερική απαλοιφή δεν επηρεάζει την σταθερότητα της πρωτεΐνης. Πειράματα έμμεσου ανοσοφθορισμού έδειξαν ότι η ίδια απαλοιφή δεν επηρεάζει την πυρηνική μετατόπιση της πρωτεΐνης. Τέλος, με πειράματα μεταγραφικής ενεργοποίησης δείχθηκε ότι αυτή η απαλοιφή κατέστειλε πλήρως την αλληλεπίδραση της Smad3 πρωτεΐνης με τον συνενεργοποιητή p/CAF. Στο δεύτερο μέρος της διατριβής, δημιουργήθηκε και εκπονήθηκε μια ενδελεχική λειτουργική χαρτογράφηση δύο σημειακών μεταλλάξεων της Smad3 πρωτεΐνης, Y237A και R287A, αμινοξέα τα οποία έρχονται σε άμεση επαφή με το αμινοξύ Ε239. Έχει καταγραφεί ότι μεταλλάξεις στο αμινοξύ Ε239 συναντιούνται συχνά σε καρκινοπαθείς. Επιπλέον, πειράματα στο εργαστήριο μας έδειξαν ότι η μεταγραφική δραστικότητα της μεταλλαγμένης Smad3 E239A καταστέλλεται πλήρως. Τα πειράματα αυτής της διατριβής έδειξαν ότι η σταθερότητα της Smad3 πρωτεΐνης επηρεάζεται σε μεγάλο βαθμό από την μετάλλαξη Ε239Α, ενώ επηρεάζεται λιγότερο από τις μεταλλάξεις Υ237Α και R287A. Η σημειακή μετάλλαξη Υ237Α δεν επηρέασε την μεταγραφική δραστικότητα της Smad3 πρωτεΐνης, τον ομο- και ετεροπολυμερισμό της με την Smad4 πρωτεΐνη και την είσοδο της στον πυρήνα. Αντίθετα, η σημειακή μετάλλαξη R287A μείωσε δραματικά την μεταγραφική ενεργότητα της Smad3 πρωτεΐνης, κατέστειλε πλήρως την ικανότητα της να σχηματίζει ομοπολυμερή και ετεροπολυμερή με την Smad4 πρωτεΐνη και εμποδίζει την είσοδο της στον πυρήνα. Η ακεραιότητα του σηματοδοτικού μονοπατιού του TGFβ είναι απαραίτητη για την φυσιολογική ανάπτυξη και την ομοιόσταση των ιστών και η διαταραχή του από μεταλλάξεις αποτελεί την βάση για πολλά κληρονομήσιμα νοσήματα και για τον καρκίνο. Η χαρτογράφηση των περιοχών της Smad3 πρωτεΐνης που ευθύνονται για την μεταγραφική της δραστικότητα καθώς και συγκεκριμένα αμινοξέα τα οποία είναι σημαντικά για την λειτουργία της και την αλληλεπίδραση της με άλλες πρωτεΐνες, θα αποτελέσει χρήσιμη γνώση για την κατασκευή μορίων που θα επάγουν την TGFβ σηματοδότηση σε περιπτώσεις μεταλλάξεων των Smad πρωτεϊνών όπως ο καρκίνος του γαστρεντερολογικού συστήματος και του πνεύμονα, ή θα την καταστέλλουν σε περιπτώσεις υπερλειτουργίας του, όπως η ίνωση και οι μεταστάσεις.
|
Μελέτη σημειακών μεταλλάξεων τηςSmad3 πρωτεΐνης του σηματοδοτικού μονοπατιού του TGFβ που πιθανόν να εμπλέκονται στον καρκίνο
