Your browser does not support JavaScript!

Αρχική    Κρυστάλλωση του υποδοχέα της HDL, SR-BI και ανάλυση της βιοχημικής του συμπεριφοράς in vitro  

Αποτελέσματα - Λεπτομέρειες

Προσθήκη στο καλάθι
[Προσθήκη στο καλάθι]
Κωδικός Πόρου 000347025
Τίτλος Κρυστάλλωση του υποδοχέα της HDL, SR-BI και ανάλυση της βιοχημικής του συμπεριφοράς in vitro
Συγγραφέας Μπανάκος, Σωτήριος
Σύμβουλος διατριβής Ζαννής, Βασίλειος
Μέλος κριτικής επιτροπής Καρδάσης, Δημήτριος
Ταλιανίδης, Ιάννης
Μπούμπας, Δημήτριος
Ηλιόπουλος, Αριστείδης
Ζαχαρλιου, Βενετία
Περίληψη Ο SR-BI (Scavenger receptor class B type I) είναι ο λειτουργικός υποδοχέας των υψηλής πυκνότητας λιποπρωτεϊνών (High Density Lipoprotein, HDL), του οποίου η τρισδιάστατη δομή είναι άγνωστη. Βασικός στόχος της διατριβής μου ήταν η παραγωγή ικανής ποσότητας ομοιογενώς τροποποιημένης, καθαρής πρωτεΐνης SR-BI, κατάλληλης για μελέτες κρυστάλλωσης. Μακροπρόθεσμος στόχος είναι η συσχέτιση της τρισδιάστατης δομής του υποδοχέα, με τις γνωστές του λειτουργίες, όσον αφορά στην επιλεκτική πρόσληψη λιπιδίων και στην κυτταρική έξοδο ελεύθερης χοληστερόλης. Προκειμένου να παραχθούν μεγάλες ποσότητες SR-BI με ομοιογενή γλυκοζυλίωση, ο υποδοχέας εκφράστηκε σε μεταλλαγμένη κυτταρική σειρά HEK (Human Embryonic Kidney), με χρήση ενός συστήματος επαγώμενης έκφρασης μέσω της προσθήκης τετρακυκλίνης. Η επαγώμενη έκφραση του SR-BI σε κυτταρικές καλλιέργειες σε βιοαντιδραστήρα, παρέκαμψε το πρόβλημα της κυτταρικής συσσωμάτωσης και αύξησε την έκφραση της πρωτεΐνης. Η κυτταρική σειρά ΗΕΚ που χρησιμοποιήθηκε για την έκφραση του SR-BI είναι μεταλλαγμένη ως προς το γονίδιο GnTI (N-acetyl Glucosaminyl Transferase I). Αυτή η μετάλλαξη οδήγησε σε ομοιόμορφη γλυκοζυλίωση του SR-BI με ολιγοσακχαρίτες υψηλής μανόζης GlcNAc(Man)5. Οι ιδιότητες γλυκοζυλίωσης του SR-BI πιστοποιήθηκαν μετά από πέψη με τα ένζυμα ενδογλυκοζιδάση Η (Endoglycosidase H, EndoH) και Ν-γλυκοζιδάση F (N-Glycosidase F, PNGase F). Η Ν-γλυκοζιδάση F πέπτει υψηλής μανόζης, καθώς και σύμπλοκες γλυκάνες. Η ενδογλυκοζιδάση Η πέπτει μόνο υψηλής μανόζης γλυκάνες. Ανάλυση κατά Western που ακολούθησε τις πέψεις επιβεβαίωσε την παραγωγή του SR-BI με τον αναμενόμενο βαθμό γλυκοζυλίωσης (μοριακή μάζα ~54kDa). Ο SR-BI που παρήχθη σε μικρή κλίμακα σε κυτταροκαλλιέργειες, απομονώθηκε με χρωματογραφία ανοσοσυγγενείας από το κυτταρικό εκχύλισμα, με χρήση σφαιριδίων σεφαρόζης συνεζευγμένων με το μονοκλωνικό αντίσωμα 1D4. Το αντίσωμα αυτό αναγνωρίζει τον επίτοπο t1, ένα εννεαπεπτίδιο (TETSQVAPA) που αντιστοιχεί στα εννέα καρβοξυτερματικά αμινοξέα της πρωτεΐνης ροδοψίνης. Ο επίτοπος t1 ενσωματώθηκε στο καρβοξυτερματικό άκρο του SR-BI με γενετική μηχανική. Ο προσδεδεμένος SR-BI εκλούσθηκε με προσθήκη περίσσειας πεπτιδίου t1 και ανιχνεύθηκε με SDS-PAGE, ανάλυση κατά Western και με χρώση αργύρου. Προκειμένου να πραγματοποιηθούν μεγάλης κλίμακας καλλιέργειες της μεταλλαγμένης κυτταρικής σειράς (HEK293SGnTITetR), χρησιμοποιήθηκε βιοαντιδραστήρας CELLIGEN PLUS, στον οποίον η θερμοκρασία, η τιμή του pH, καθώς και το περιεχόμενο της καλλιέργειας σε οξυγόνο, άζωτο, διοξείδιο του άνθρακος και αέρα, ελέγχεται ηλεκτρονικά. Η κυτταρική πυκνότητα που επετεύχθη στο βιοαντιδραστήρα ήταν περίπου 5 Χ 106 κύτταρα / ml (ολικός όγκος καλλιέργειας 5.5L). Χρησιμοποιώντας μεγάλης κλίμακας χρωματογραφία ανοσοσυγγενείας, παρήχθησαν περίπου 5-8 χιλιοστογραμμάρια καθαρής πρωτεΐνης ανά 5.5 λίτρα καλλιέργειας. Μέρος της απομονωμένης πρωτεΐνης ενσωματώθηκε σε λιποσώματα αποτελούμενα από χοληστερόλη και φωσφατιδυλχολίνη (και σε κάποιες περιπτώσεις, σφιγγομυελίνη), τα οποία χρησιμοποιήθηκαν σε μια δοκιμασία πρόσδεσης σε φίλτρα νιτροκυτταρίνης. Αυτή η δοκιμασία επέτρεψε τον υπολογισμό της ποσότητας των λιποπρωτεϊνών που προσδένονται στα πρωτεολιποσώματα και των αιθέρων χοληστερόλης που προσλαμβάνονται από αυτά, μέσω του SR-BI. Αυτές οι αναλύσεις έδειξαν ότι ο απομονωμένος και μεταλλαγμένος ως προς τη γλυκοζυλίωσή του, SR-BI, είναι λειτουργικός και ότι προσδένει 125Ι-HDL και προσλαμβάνει αιθέρες χοληστερόλης από την [3Η]-CE-HDL σε επίπεδα παρόμοια με τον αγρίου τύπου mSR-BI-t1. Αύξηση στη συγκέντρωση του CaCl2 στο ρυθμιστικό διάλυμα οδήγησε σε αυξημένη πρόσδεση της HDL, αλλά δεν επηρέασε την πρόσληψη των αιθέρων χοληστερόλης. Η πρόσδεση της HDL και της LDL ήταν μεγαλύτερη στους 37oC, ενώ η πρόσληψη των αιθέρων χοληστερόλης αυξήθηκε με την αύξηση της θερμοκρασίας. Η πρόσδεση της HDL αυξήθηκε με τη μείωση του pH, χωρίς να επηρεάσει την πρόσληψη των αιθέρων χοληστερόλης. Προσθήκη σφιγγομυελίνης στα λιποσώματα αύξησε την πρόσληψη των αιθέρων χοληστερόλης από την HDL, αλλά όχι και την πρόσδεση της 125I-HDL. Οι χημικές ενώσεις BLT-1, 2, 3, 4 και 5, αναστέλλουν την επιλεκτική πρόσληψη λιπιδίων από την HDL. Η δοκιμασία πρόσδεσης έδειξε ότι στόχος των BLT’s είναι ο ίδιος ο SRBI. Αντικατάσταση της ομάδας θειόλης του BLT-1, το οποίο ανήκει στην οικογένεια των θειοημικαρβαζών, με άτομο οξυγόνου, οδήγησε σε παραγωγή ανενεργού ισομορφής του BLT-1. Αυτές οι μελέτες απεκάλυψαν επίσης τη σημασία της υδρόφοβης «ουράς» του BLT-1 στην αναστολή της δράσης του SR-BI. Μέρος της πρωτεΐνης που απομονώθηκε με χρωματογραφία ανοσοσυγγενείας υπεβλήθη σε περαιτέρω καθαρισμό με χρωματογραφία μοριακής διήθησης και χρωματογραφία ιοντοανταλλαγής, οι οποίες έδειξαν ότι τα παρασκευάσματα του SR-BI ήταν ομοιογενώς καθαρά. Επίσης διερευνήθηκε η επίδραση του pH, της διθειοθρεϊτόλης (dithiothreitol, DTT), της θερμοκρασίας και της ηλικίας των πρωτεϊνικών δειγμάτων, στη σταθερότητα και τον ολιγομερισμό του SR-BI κατά τη χρωματογραφία. Η κρυστάλλωση του καθαρισμένου SR-BI οδήγησε στην παραγωγή μικρών, εξαγωνικών κρυστάλλων, μήκους 30-40 μm, τα οποία υποβάλλονται σε κρυσταλλογραφικές μελέτες προκειμένου να διαλευκανθεί η ατομική δομή του SR-BI.
Φυσική περιγραφή xviii, 220 σ. : πιν. ; 30 εκ.
Γλώσσα Ελληνικά
Θέμα Lipoproteins
Λιποπρωτεϊνες
Ημερομηνία έκδοσης 2008-07-30
Συλλογή   Σχολή/Τμήμα--Σχολή Επιστημών Υγείας--Τμήμα Ιατρικής--Διδακτορικές διατριβές
  Τύπος Εργασίας--Διδακτορικές διατριβές
Σημειώσεις Πρόγραμμα Μοριακής Βιολογίας-Βιοϊατρικής
Εμφανίσεις 43

Ψηφιακά τεκμήρια
No preview available

Προβολή Εγγράφου
Εμφανίσεις : 4