| Περίληψη |
Η αιτιολογική συσχέτιση του καρκίνου του τραχήλου της μήτρας και της μόλυνσης από τον ιό του θηλώματος του ανθρώπου (human papillomavirus, HPV) είναι αδιαμφισβήτητη. Οι υψηλού κινδύνου τύποι του ιού HPV εκφράζουν τις ογκοπρωτεΐνες Ε6 και Ε7, που μπορούν να αδρανοποιούν τις ογκοκατασταλτικές πρωτεΐνες p53 (TP53) και ρετινοβλάστωμα (RB1) αντίστοιχα. Συνεπώς ο ιός καταλαμβάνει τον έλεγχο τόσο του κυτταρικού κύκλου όσο και του μηχανισμού της απόπτωσης. Οι ογκοκατασταλτικές πρωτεΐνες TP53 και RB1 ελέγχουν επιπλέον αμέσως την μεταγραφική ενεργότητα της RNA πολυμεράσης III (RNA polymerase III, RNA pol III). Οι αλλαγές στην ενεργότητα αυτού του ενζύμου αντικατοπτρίζονται στην βιοσυνθετική ικανότητα του κυττάρου. Σκοπός της παρούσας διδακτορικής διατριβής ήταν η μελέτη της RNA pol III μεταγραφής σε κύτταρα καρκίνου τραχήλου της μήτρας μολυσμένα με υψηλού κινδύνου τύπους του ιού HPV, αναφορικά με τη ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου, το βαθμό ενεργοποίησης του κυττάρου και της δέσμευσής του για μίτωση, διαβαίνοντας το κατώφλι από τη φάση του κυτταρικού κύκλου G1 στη φάση S. Για το σκοπό αυτό αναλύθηκαν βιοψίες από 35 περιστατικά καρκίνου τραχήλου της μήτρας, 26 υψηλού (HSIL) και 33 χαμηλού βαθμού ενδοεπιθηλιακών αλλοιώσεων (LSIL) καθώς και 28 φυσιολογικοί τράχηλοι της μήτρας σαν ομάδα ελέγχου. Από το υλικό αυτό απομονώθηκε ολικό DNA, RNA και πρωτεΐνες. Πραγματοποιήθηκε έλεγχος με τη μέθοδο της PCR της παρουσίας DNA του ιού HPV σε όλα τα δείγματα και ταυτοποίηση του τύπου του ιού, όπου αυτός εντοπίσθηκε. Σε κανένα δείγμα της ομάδας ελέγχου των φυσιολογικών τραχήλων της μήτρας δεν εντοπίσθηκε HPV DNA. Επιπλέον εξετάστηκε το ενδεχόμενο το DNA του ιού να έχει ενσωματωθεί στο γονιδίωμα του ξενιστή ή να διατηρείται επισωματικώς. Η ενσωμάτωση του DNA του ιού στο γονιδίωμα του ξενιστή έχει σαν αποτέλεσμα την απώλεια της έκφρασης του Ε2 γονιδίου του HPV που κωδικοποιεί για μια πρωτεΐνη που καταστέλλει την έκφραση των ογκοπρωτεϊνών Ε6 και Ε7. Έτσι οι τελευταίες εκφράζονται σε πολύ υψηλότερα επίπεδα από ότι όταν ο ιός εντοπίζεται επισωματικώς. Τα επίπεδα λειτουργίας της RNA pol III μεταγραφής και η ρύθμισή της σε κύτταρα καρκίνου τραχήλου της μήτρας μολυσμένα με υψηλού κινδύνου HPV εξετάστηκαν. Για το σκοπό αυτό πραγματοποιήθηκε RT-PCR ανάλυση των πρωτογενών μεταγράφων γονιδίων κλάσεως ΙΙΙ, γονιδίων που μεταγράφονται από την RNA pol III, όπως tRNAs (tRNATyr, tRNAArg, tRNALeu), 5S rRNA, MRP RNA, ένα μόριο RNA που χρειάζεται για την αντιγραφή του μιτοχονδριακού DNA και την ωρίμανση των μεγάλων rRNA, και του 7SK RNA, που ρυθμίζει έναν μεταγραφικό παράγοντα επιμήκυνσης της RNA πολυμεράσης ΙΙ. Διαπιστώθηκε πως οι βιοψίες καρκίνου τραχήλου της μήτρας εκφράζουν σε υψηλότερα επίπεδα τα tRNAs και 5S rRNA σε σχέση με την ομάδα ελέγχου. Παράλληλα, όταν ο HPV είχε ενσωματωθεί στο γονιδίωμα του ξενιστή η έκφραση των προϊόντων της RNA pol III ήταν υψηλότερη. Τα 7SK και MRP μετάγραφα παρουσίασαν διαφορετικά πρότυπα έκφρασης κάτι που πιθανά οφείλεται στην διαφορετική διάταξη των υποκινητών που χρησιμοποιούνται στην μεταγραφή τους. Ανάλυση των επιπέδων έκφρασης του μεταγραφικού παράγοντα της RNA pol III, TFIIIC2, ο οποίος αποτελείται από πέντε υπομονάδες, TFIIICα, TFIIICβ, TFIIIC90, TFIIIC102 και TFIIIC63, έδειξε σημαντικές αποκλίσεις μεταξύ διαφορετικών δειγμάτων. Φαίνεται πως ο TFIIIC2 δεν είναι περιοριστικός παράγοντας για την RNA pol III μεταγραφή στα κύτταρα του τραχήλου της μήτρας και πως ο HPV δεν επάγει την έκφραση των υπομονάδων, ενώ η ενσωμάτωση του ιού στο γονιδίωμα του ξενιστή τα επάγει. Ανάλυση των επιπέδων έκφρασης του μεταγραφικού παράγοντα της RNA pol III, TFIIIΒ, ο οποίος αποτελείται από τρεις υπομονάδες, τις TBP, Brf1 και Bdp1, έδειξε πως ο Brf1 συσχετίζεται με τη νόσο, την παρουσία HPV, επισωματικώς ή ενσωματωμένου στο γονιδίωμα του ξενιστή και τα επίπεδα μεταγραφής της RNA pol III. Τα αυξημένα επίπεδα έκφρασης του μεταγραφικού παράγοντα Brf1 δεν συνδέονται με την αδρανοποίηση των TP53 και RB1 από τις Ε6 και Ε7 αντίστοιχα. Τα αποτελέσματα οδηγούν στην υπόθεση πως ο Brf1 είναι περιοριστικός παράγοντας της RNA pol III μεταγραφής στα κύτταρα του τραχήλου της μήτρας. Με δεδομένο πως η RNA pol III μεταγραφή αυξάνεται σημαντικά κατά την διάρκεια της μετάβασης από την G1 στην S φάση του κυτταρικού κύκλου εξετάστηκε η απόκριση του Brf1 στις φάσεις G1 και S, σε κυτταρικές σειρές HeLa που διαμολύνθηκαν με φορέα που υπερεκφράζει τον Brf1 και συγχρονίστηκαν. Έτσι διαπιστώθηκε πως ο Brf1 ενεργοποιεί την μεταγραφή των tRNA και 5S rRNA στην φάση G1 και του 5S rRNA στην φάση S του κυτταρικού κύκλου. Συμπερασματικά, τρεις συμπληρωματικοί μηχανισμοί μπορεί να είναι υπεύθυνοι για τα υψηλά επίπεδα παραγωγής tRNA και 5S rRNA στα κύτταρα καρκίνου της μήτρας μολυσμένα από υψηλού κινδύνου ιό HPV: α) αδρανοποίηση της TP53 από την Ε6, β) αδρανοποίηση της RB1 από την Ε7 και γ) επαγωγή της μεταγραφής του Brf1. Τελικό αποτέλεσμα είναι η αύξηση της βιοσυνθετικής ικανότητας των καρκινικών κυττάρων η οποία μπορεί να συμβάλλει στον εκτός ελέγχου πολλαπλασιασμό τους. Για την μελέτη της μετάβασης του κυτταρικού κύκλου από την φάση G1 στην S σε κύτταρα καρκίνου τραχήλου της μήτρας μολυσμένα από υψηλού κινδύνου τύπο του ιού HPV, πραγματοποιήθηκε ανάλυση των επιπέδων έκφρασης 24 γονιδίων. Τα γονίδια που εξετάστηκαν περιλαμβάνουν κύρια και ρυθμιστικά γονίδια του κυτταρικού κύκλου όπως κυκλίνες (cyclins, CCNs) και κυκλινο-εξαρτώμενες κινάσες (cyclin-dependent kinases, CDKs), αναστολείς των CDKs (CDKNs) και των δύο οικογενειών Cip/Kip και ΙΝΚ4, γονίδια της οικογένειας των μεταγραφικών παραγόντων E2F, γονίδια της οικογένειας RB1 (pocket proteins) και TP53 καθώς και γονίδια των οποίων η μεταγραφή ελέγχεται από τους μεταγραφικούς παράγοντες E2F και τα οποία είναι απαραίτητα κατά την φάση S του κυτταρικού κύκλου. Η μετάβαση του κυτταρικού κύκλου από την φάση G1 στην S απαιτεί την παρουσία των δύο ολοενζύμων, κυκλίνη D με Cdk4 και Cdk6, καθώς και κυκλίνη Ε με Cdk2. Η ρύθμιση του σημείου αυτού ελέγχου (checkpoint) του κυτταρικού κύκλου βασίζεται στα μονοπάτια της TP53 (TP53-MDM2-CDKN1A-CDKN2D) και RB1 (RB1-E2F-CCND1-CDK4-CDK6-CDKN2A). Έτσι φαίνεται πως η αδρανοποίηση των πρωτεϊνών TP53 και RB1 από τις ογκοπρωτεΐνες Ε6 και Ε7 των υψηλού κινδύνου τύπων του HPV είναι ικανό γεγονός για να προκαλέσει απορύθμιση του G1/S ελέγχου και καρκινογένεση. Κάτι τέτοιο όμως δεν συμβαίνει στην πράξη. Η αδρανοποίηση είναι απαραίτητη προϋπόθεση για την ογκογένεση στον τράχηλο της μήτρας όχι όμως και ικανή συνθήκη που να μετατρέπει φυσιολογικά κύτταρα σε αθανατοποιημένα ή καρκινικά. Επιπρόσθετα γεγονότα χρειάζονται ώστε μέσα από γενετικές και επιγενετικές αλλαγές, από την ενεργοποίηση πρωτο-ογκογονιδίων και την απώλεια ογκοκατασταλτικών αλλά και μέσα από ανοσολογικές αποκρίσεις, τα μολυσμένα με υψηλού κινδύνου HPV κύτταρα του τραχήλου της μήτρας να εξελιχθούν σε καρκινικά. Οι ενδοεπιθηλιακές αλλοιώσεις του καρκίνου της μήτρας (HSIL και LSIL) που έχουν υψηλού κινδύνου HPV και εκφράζουν τις Ε6 και Ε7 δεν δείχνουν την ανάπτυξη ή την επιθετικότητα των όγκων, ενώ ο καρκίνος του τραχήλου αναπτύσσεται σπάνια και μετά από δεκαετίες έπειτα από μόλυνση με υψηλού κινδύνου HPV. Οι παρατηρήσεις αυτές μας δείχνουν πως άλλες ρυθμιστικές πρωτεΐνες της G1/S μετάβασης μπορεί να δρουν ώστε να αντισταθμίζουν την επιθετική αύξηση. Από τα 24 γονίδια που εξετάστηκαν πέντε, τα RBL2, E2F2, CDK6, CCNE1 και MYC, βρέθηκαν να υπερεκφράζονται στον καρκίνο του τραχήλου στο 80%, 80%, 97%, 74% και 74% των περιστατικών που εξετάστηκαν, αντίστοιχα. Οκτώ γονίδια βρέθηκαν να υπερεκφράζονται τόσο στον καρκίνο του τραχήλου όσο και στο HSIL, τα E2F1 στο 84% και 71% των καρκίνων και HSILs, αντίστοιχα, E2F3 στο 81% και 74%, E2F5 στο 86% και 81%, CCND1 στο 77% και 52%, CDK2 στο 88% και 62%, CDKN1B στο 86% και 77%, PCNA στο 89% και 69%, καθώς και το POLA στο 62% και 52%. Μόνο πέντε από τα 24 γονίδια που εξετάστηκαν βρέθηκαν σε υψηλά επίπεδα και στις τρεις ομάδες δειγμάτων καρκίνο τραχήλου, HSIL και LSIL σε σχέση με την ομάδα ελέγχου τα TP53 αυξημένο στο 80% των όγκων, 69% των HSILs και 64% των LSILs, E2F4 στο 89%, 81% και 76%, CDKN1A στο 82%, 73% και 70%, CDKN2A στο 86%, 82% και 77% καθώς και το DHFR στο 75%, 70% και 62%, αντίστοιχα. Το γονίδιο MDM2 παρουσιάζει ένα μοναδικό πρότυπο με υπερέκφραση στο 88% και 73% των HSILs και LSILs, αντίστοιχα. Το RBL1 βρέθηκε να υποεκφράζεται στο 97%, 88% και 73% των όγκων, HSILs και LSILs. Το TP73 παρουσίασε χαμηλότερα επίπεδα στο 60% των καρκίνων του τραχήλου. Ωστόσο, οι ισομορφές του TP73 που περιείχαν το εξόνιο 13 ήταν σημαντικά αυξημένες στο 73% και 69% των καρκίνων και HSILs, ενώ οι ισομορφές που περιείχαν το εξόνιο 2 βρέθηκαν μειωμένες στο 97% και 73% των όγκων και HSILs αντίστοιχα. Τρία γονίδια, τα RB1, CDK4 και CDKN2D, έδειξαν παρόμοια επίπεδα έκφρασης. Τα αποτελέσματα αυτά υποδεικνύουν πως η απορύθμιση της G1/S μετάβασης κατά την διάρκεια της καρκινογένεσης του τραχήλου της μήτρας είναι μια προοδευτική διαδικασία. Συγκεκριμένες ομάδες γονιδίων ενεργοποιούνται πολύ νωρίς στις προ-καρκινικές καταστάσεις LSIL και HSIL ενώ άλλα ενεργοποιούνται αργότερα κατά τον καρκινικό μετασχηματισμό των κυττάρων. Τα δεδομένα αυτά έχουν σημαντική κλινική αξία. Ιεραρχική ταξινόμηση των 122 συνολικά δειγμάτων που εξετάστηκαν ανάλογα με την έκφραση των 24 γονιδίων που μελετήθηκαν διαχώρισε τα δείγματα σε ομάδες ανάλογα με την νόσο με ελάχιστα λάθη (6,6%). Παράλληλα τα γονίδια ομαδοποιήθηκαν σε 3 ομάδες ανάλογα με την έκφρασή τους, υψηλή, CDK4, E2F3, E2F5, E2F1, RB1 PCNA, CDKN1B, TP53 και DHFR, μέτρια, POLA, CCND1, CDK2, E2F4, CDK6, MDM2, CDKN2D, MYC, CDKN1A, RBL2, E2F2, TP73 ισόμορφα που περιέχουν το εξόνιο 13, CCNE1 και CDKN2A, και χαμηλή, TP73 ισόμορφα που περιέχουν το εξόνιο 2, RBL1 και TP73. Τα αποτελέσματα αυτά υποδεικνύουν πιθανές διαγνωστικές εφαρμογές.
|
Μελέτη του ενζύμου της RNA πολυμέρασης III σε δείγματα καρκίνου του τραχήλου της μήτρας που έχουν μολυνθεί από τον ιο του θηλώματος του ανθρώπου (HPV)
