| Περίληψη |
Η χιτίνη είναι ο δεύτερος πιο διαδεδομένος δομικός πολυσακχαρίτης στη φύση μετά την κυτταρίνη. Η χιτοζάνη (απακετυλιωμενή μορφή χιτίνης) δεν απαντάται στην φύση τόσο συχνά όσο η χιτίνη. Όμως, οι ελεύθερες αμινομάδες κατά μήκος του πολυμερούς προσδίδουν καινούργιες και εντελώς διαφορετικές ιδιότητες στο μόριο αυτό. Σε κάποια είδη μυκήτων η χιτοζάνη αποτελεί ένα σημαντικό συστατικό του κυτταρικού τοιχώματος σε διάφορες φάσεις του κυτταρικού κύκλου. Οι απακετυλάσες της χιτίνης στους μύκητες συμμετέχουν στη δημιουργία του κυτταρικού τους τοιχώματος και φαίνεται ότι παίζουν κάποιο ρόλο στις αλληλεπιδράσεις φυτού-παθογόνου.
Ο μύκητας Cryptococcus neoformans είναι ένα κοινό ευκαιριακό παθογόνο σε παγκόσμιο επίπεδο. Στο κυτταρικό τοίχωμα του C. neoformans εντοπίζεται σε μεγάλο ποσοστό η χιτίνη, το μεγαλύτερο μέρος της οποίας είναι απακετυλιωμένο σε χιτοζάνη. Η χιτίνη και η χιτοζάνη αποτελούν πολύ καλούς στόχους για μελλοντικά αντιμυκητιακά φάρμακα λόγω της σημασίας τους για την ακεραιότητα του κυττάρου και την απουσία τους στον άνθρωπο. Μέχρι σήμερα έχουν αναγνωριστεί τρεις απακετυλάσες πολύσακχαριτών (που εμφανίζουν μεγάλη ομοιότητα με απακετυλάσες της χιτίνης) στον C. neoformans που παρουσιάζουν ανοσολογικό ενδιαφέρον. Επιπλέον, η ανοσοποίηση με τις απακετυλάσες MP98, MP84 και D25 έχει προστατευτικές δράσεις για τον ξενιστή και έτσι αποτελούν υποψήφιους αντιγονικούς επιτόπους για την ανάπτυξη εμβολίου για την κρυπτοκοκκίωση.
Ο μύκητας Fusarium graminearum προσβάλει τα σιτηρά, το καλαμπόκι και το ρύζι και έχει χαρακτηριστεί ως το πιο σοβαρό φυτοπαθογόνο την τελευταία δεκαετία. Η αποίκιση ενός φυτού από τον μύκητα φέρνει τα κύτταρα των οργανισμών κοντά και έτσι το κυτταρικό τοίχωμα του μύκητα παίζει σημαντικό ρόλο στην αλληλεπίδραση του με τον ξενιστή. Ύστερα από ανάλυση του γονιδιώματος του F. graminearum βρέθηκε ότι υπάρχουν εννέα απακετυλάσες πολυσακχαριτών, εκ των οποίων οι τρεις κωδικοποιούν για απακετυλάσες που φέρουν περιοχές πρόσδεσης της χιτίνης. Οι απακετυλάσες αυτές έχουν ιδιαίτερο ενδιαφέρον καθώς έχει βρεθεί ότι οι περιοχές αναγνώρισης της χιτίνης αυξάνουν την αποτελεσματικότητα δράσης των χιτινασών σε αδιάλυτα υπόστρωμα χιτίνης και φαίνεται ότι εμπλέκονται στην αναγνώριση και προσβολή του ξενιστή.
Ο βασικός στόχος της μελέτης αφορά στην απομόνωση του μεταγράφου του fg04146, στην κλωνοποίηση των γονιδίων d25, mp84, mp98 και στην υπερέκφραση των πρωτεϊνών που αυτά κωδικοποιούν. Υποθέτουμε ότι το γονίδιο fg04146 είναι σιωπηλό, δηλαδή δεν εκφράζεται, τουλάχιστον κάτω από συνθήκες έλλειψης αζώτου και άνθρακα αντίστοιχα που χρησιμοποιήθηκαν για τη δημιουργία των cDNA βιβλιοθηκών και κάτω από τις συνθήκες ανάπτυξης του μύκητα στο εργαστήριο. Για την κλωνοποίηση των γονιδίων d25 και mp84 στον pKLAC1 φορέα έκφρασης εφαρμόστηκε η στρατηγική κλωνοποίησης I (φυσικό αμινοτελικό άκρο στην παραγόμενη πρωτεΐνη) ενώ για το mp98 η στρατηγική κλωνοποίησης II (μη-φυσικό αμινοτελικό άκρο στην παραγόμενη πρωτεΐνη) σύμφωνα με τις οδηγίες του πρωτοκόλλου που εφαρμόστηκε. Η εισαγωγή της κασέτας έκφρασης γίνεται με χημικό μετασχηματισμό στα κύτταρα K. lactis. Τα μετασχηματισμένα κύτταρα ελέγχονται με PCR για τη σωστή ένθεση της κασέτας έκφρασης καθώς και για την πολλαπλή ένθεση της. Έγινε ανάπτυξη των σωστά μετασχηματισμένων κυττάρων για ανίχνευση της εκκρινόμενης πρωτεΐνης με ηλεκτροφορητική ανάλυση πρωτεϊνών από το υπερκείμενο των καλλιεργειών.
|
Μελέτη των απακετυλασών της χιτίνης από τους μύκητες Fusarium graminearum και Cryptococcus neoformans
