Your browser does not support JavaScript!

Αρχική    Διερεύνηση της παράδοξης δράσης των εχινοκανδινών εναντίων των υφομυκήτων του γένους Aspergillus  

Αποτελέσματα - Λεπτομέρειες

Προσθήκη στο καλάθι
[Προσθήκη στο καλάθι]
Κωδικός Πόρου 000410070
Τίτλος Διερεύνηση της παράδοξης δράσης των εχινοκανδινών εναντίων των υφομυκήτων του γένους Aspergillus
Άλλος τίτλος Dissecting the echinocandin paradoxical activity against the fungus aspergillus
Συγγραφέας Ιωάννου, Πέτρος
Σύμβουλος διατριβής Σαμώνης, Γεώργιος
Περίληψη ΕΙΣΑΓΩΓΗ: Οι μύκητες του γένους Aspergillus είναι σαπροφυτικοί υφομύκητες που αποτελούν δυνητικά θανάσιμο κίνδυνο για ασθενείς με ανοσοκαταστολή, όπως για τους πάσχοντες από αιματολογική ή συμπαγή κακοήθεια, ή αυτούς που λαμβάνουν ανοσοκατασταλτικά λόγω μεταμόσχευσης οργάνου. Οι εχινοκανδίνες αποτελούν μια νεότερη κατηγορία αντιμυκητικών φαρμάκων που έχει δείξει αξιόλογη in vivo δραστικότητα εναντίον των μυκήτων αυτών, αλλά μέτρια δράση εναντίον τους σε in vitro συνθήκες, όπως για παράδειγμα συμβαίνει στα συνήθη test ευαισθησίας των εχινοκανδινών στο εργαστήριο. Η παρούσα διδακτορική διατριβή, προσπαθεί να διερευνήσει τους μηχανισμούς που προκαλούν αυτή τη διαφορά ανάμεσα στην in vitro και την in vivo δραστικότητα των εχινοκανδινών εναντίον των Ασπεργίλλων ΥΛΙΚΑ ΚΑΙ ΜΕΘΟΔΟΙ: Χρησιμοποιήθηκαν στελέχη διαφόρων μυκήτων του γένους Aspergillus καθώς και ορισμένα του γένους Candida ως μάρτυρες, και έγιναν test ευαισθησίας στις εχινοκανδίνες και στη βορικοναζόλη σε 6 διαφορετικά στελέχη του γένους Aspergillus σε συνθήκες σύμφωνα με τις προκαθορισμένες για τα test ευαισθησίας σε υφομύκητες, αλλά και σε θρεπτικό υλικό κυτταροκαλλιεργειών, ώστε να προσομοιάζει τις συνθήκες που υπάρχουν στους ανθρώπινους ιστούς που πάσχουν από Ασπεργίλλωση. Τα ίδια test επαναλήφθηκαν σε στέλεχος Aspergillus fumigatus με κασποφουγκίνη σε θρεπτικό υλικό τροποποιημένο ως προς τη σύστασή του (συγκέντρωση Hepes ή MOPS, pH, παρουσία CO2, περιεκτικότητα σε γλυκόζη) και στη συνέχεια ως προς το αν περιείχε ή όχι βόειο ορό, ή αν περιείχε βόειο αλβουμίνη ή 13 αλβουμίνη σεσημασμένη με το φθορίζον μόριο FITC (Fluorescein isothiocyanate). Σε κάθε περίπτωση εξεταζόταν στο απλό φωτονικό μικροσκόπιο η ελάχιστη συγκέντρωση στην οποία εμφανιζόταν η επίδραση του αντιμυκητικού φαρμάκου (δομικές βλάβες για τις εχινοκανδίνες και αναστολή ανάπτυξης για τη βορικοναζόλη – Minimum Effective/Inhibitory Concentration – MEC/MIC) καθώς και η μεταβολική δραστηριότητα του μύκητα με βάση την αναγωγή του αντιδραστηρίου XTT ((2,3)-bis (2-Methoxy 4-Nitro 5-Sulphenyl) (2H) Tetrazolium Carboxanilide), ή το φθορισμό που προέκυπτε μετά την προσθήκη του αντιδραστηρίου CFDA (6-carboxyfluorescein diacetate). Παρόμοια πειράματα έγιναν και με την ανιδουλαφουγκίνη και τη μικαφουγκίνη αλλά με μικρότερο αριθμό πειραμάτων, για επιβεβαίωση ή όχι του φαινοτύπου. Τα δεδομένα αναλύονταν στατιστικά και συγκρίνονταν οι διαφορετικές συνθήκες ως προς τη διαφορά της ελάχιστης συγκέντρωσης φαρμάκου για την εμφάνιση του φαινοτύπου (Minimum Effective Concentration – MEC), την ελάχιστη συγκέντρωση για να μειωθεί κατά 50% η μεταβολική δραστηριότητα του μύκητα (Effective Concentration 50 – EC50), και την κλίση των καμπύλων που προέκυπτε με ανασύνθεση με μη γραμμική παλινδρόμηση (Hill’s equation). Πραγματοποιήθηκαν πειράματα ελεγχόμενα από συνεστιακό μικροσκόπιο με παρουσία και χωρίς παρουσία βόειου αλβουμίνης με φθορίζουσα χρωστική FITC σε μύκητες του είδους Aspergillus fumigatus α) σε διαφορετικά στάδια βλάστησής τους, β) με προηγούμενη και χωρίς προηγούμενη έκθεση σε κασποφουγκίνη γ) με προηγούμενη και χωρίς προηγούμενη έκθεση σε μεγάλες συγκεντρώσεις βόειου αλβουμίνης. Πραγματοποιήθηκαν επίσης πειράματα ελεγχόμενα από συνεστιακό μικροσκόπιο σε μύκητες του είδους Aspergillus fumigatus παρουσία και απουσία βόειου αλβουμίνης, παρουσία 14 σεσημασμένης με φθορίζουσα χρωστική κασποφουγκίνης, καθώς και πειράματα ελεγχόμενα από ηλεκτρονικό μικροσκόπιο σάρωσης με τον ίδιο μύκητα, παρουσία αλβουμίνης και ταυτόχρονα παρουσία ή απουσία κασποφουγκίνης. Τέλος, έγινε ανοσοφθορισμός με αντίσωμα ποντικού εναντίον β-γλουκάνης και δευτεροταγές φθορίζον αντίσωμα εναντίον ποντικού σε υφές μυκήτων που είχαν αναπτυχθεί σε αυξανόμενες συγκεντρώσεις κασποφουγκίνης παρουσία και απουσία βόειου ορού και μελέτη των δειγμάτων σε συνεστιακό μικροσκόπιο. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ: Από τα test ευαισθησίας στα αντιμυκητικά που πραγματοποιήθηκαν στα 6 στελέχη μυκήτων του γένους Aspergillus, παρατηρήθηκε πως η κασποφουγκίνη έχει αυξημένη δράση εναντίον των μυκήτων στο θρεπτικό υλικό κυτταροκαλλιεργειών που προσομοιάζει κατά προσέγγιση σε συνθήκες ανθρώπινου οργανισμού, πράγμα το οποίο δε συμβαίνει με τη βορικοναζόλη. Αυτή η αυξημένη δράση συνίσταται σε μικρότερες MEC και EC50 για την κασποφουγκίνη. Σε μια σειρά πειραμάτων που έγιναν για να βρεθεί ποια ουσία εντός του θρεπτικού υλικού σχετίζεται με αυξημένη δραστικότητα της κασποφουγκίνης, βρέθηκε πως αυτή ήταν ο βόειος ορός, και πιο συγκεκριμένα, η βόειος αλβουμίνη, πράγμα το οποίο επιβεβαιώθηκε και με ηλεκτρονικό μικροσκόπιο, όπου αναδείχθηκαν με λεπτομέρεια οι δομικές βλάβες στο τοίχωμα των μυκήτων. Στη συνέχεια έγιναν περαιτέρω πειράματα, αυτή τη φορά υπό συνεστιακό μικροσκόπιο, που έδειξαν πως η βόειος αλβουμίνη συνδέεται στους μύκητες του γένους Aspergillus, αλλά περισσότερο στις βλασταίνουσες μορφές του, και πως η κασποφουγκίνη συνδέεται περισσότερο στη επιφάνεια των μυκήτων παρουσία αλβουμίνης, ενώ και η αυξημένη έκθεση της β- 15 γλουκάνης παρουσία κασποφουγκίνης είναι μεγαλύτερη όταν στο περιβάλλον υπάρχει και βόειος ορός. Παραδόξως, ο ανωτέρω περιγραφείς φαινότυπος δεν επιβεβαιώθηκε με την ανιδουλαφουγκίνη και τη μικαφουγκίνη. ΣΥΖΗΤΗΣΗ: Τα πειράματα που περιγράφονται στην παρούσα διδακτορική διατριβή δείχνουν πως η δράση της κασποφουγκίνης, αλλά παραδόξως όχι της ανιδουλαφουγκίνης και της μικαφουγκίνης, αυξάνεται περισσότερο σε θρεπτικό υλικό κυτταροκαλλιεργειών, που προσομοιάζει περισσότερο στις συνθήκες που επικρατούν στους ιστούς ασθενών με λοίμωξη από Ασπέργιλλο. Αυτή η αυξημένη δράση της κασποφουγκίνης, όπως προκύπτει από τα παρόντα πειράματα, σχετίζεται με την αυξημένη ικανότητα που έχει η αλβουμίνη να συνδέεται πάνω στο τοίχωμα του μύκητα Aspergillus, ιδίως όταν αυτός βρίσκεται σε φάση βλάστησης και όχι στο στάδιο των κονιδίων σε κατάσταση αδρανείας. Παρουσία κασποφουγκίνης, η πρόσδεση της αλβουμίνης είναι μεγαλύτερη, αλλά και παρουσία αλβουμίνης η πρόσδεση της κασποφουγκίνης είναι μεγαλύτερη, φαινόμενο που πιθανόν σημαίνει πως μπορεί η αλβουμίνη να δρα ως μόριο-μεταφορέας της κασποφουγκίνης πάνω στο τοίχωμα του μύκητα, αυξάνοντας έτσι τη δράση της και οδηγώντας σε έναν θετικά ανατροφοδοτούμενο κύκλο, εφόσον και η αυξημένη πρόσδεση και δράση της κασποφουγκίνης συνεπάγεται την περαιτέρω αύξηση της πρόσδεσης της αλβουμίνης στο τοίχωμα του Ασπεργίλλου. Επιπλέον, δεδομένου ότι στη βιβλιογραφία έχει προταθεί ως ερμηνεία της διαφοράς στην in vivo και την in vitro δράση των εχινοκανδινών η αυξημένη έκθεση της β-γλουκάνης στο τοίχωμα των μυκήτων του γένους Aspergillus μετά από έκθεση στις εχινοκανδίνες, πραγματοποιήθηκαν 16 πειράματα ελεγχόμενα με συνεστιακή μικροσκοπία σε Ασπέργιλλο που είχε εκτεθεί σε αυξανόμενες συγκεντρώσεις κασποφουγκίνης και παρατηρήθηκε πως όταν ο μύκητας είχε εκτεθεί σε βόειο ορό, η έκθεση της β-γλουκάνης ήταν μεγαλύτερη. Αυτοί οι δύο μηχανισμοί θα μπορούσαν να εξηγούν τη διαφορά στην in vivo και την in vitro δραστικότητα της κασποφουγκίνης.
Φυσική περιγραφή 177 , [8] σ. : εικ.πιν.σχήμ. ; 30 εκ.
Γλώσσα Ελληνικά
Θέμα Ασπεργίλλος
Ημερομηνία έκδοσης 2017-07-26
Συλλογή   Σχολή/Τμήμα--Σχολή Επιστημών Υγείας--Τμήμα Ιατρικής--Διδακτορικές διατριβές
  Τύπος Εργασίας--Διδακτορικές διατριβές
Εμφανίσεις 116

Ψηφιακά τεκμήρια
No preview available

Προβολή Εγγράφου
Εμφανίσεις : 4