| Περίληψη |
Ο μετασχηματίζων αυξητικός παράγοντας-β (TGF-β) ρυθμίζει πολλές πτυχές της κυτταρικής
συμπεριφοράς, όπως ο κυτταρικός πολλαπλασιασμός, η διαφοροποίηση και η
μεταναστευτικότητα, διαδικασίες οι οποίες χρειάζονται την ενεργή αναδιοργάνωση του
κυτταροσκελετού της ακτίνης και των μικροσωληνίσκων, αλλά και τη ρύθμιση της
συσταλτικότητας του κυττάρου. Ο TGF-β έχει δειχθεί, ότι ρυθμίζει τη σύντομη και μακροχρόνια
αναδιοργάνωση του κυτταροσκελετού της ακτίνης μέσω των Rho GTPασών σε μία ποικιλία
κυτταρικών τύπων, όπως ινοβλάστες, επιθηλιακά και λεία μυϊκά κύτταρα. Ένα σύνολο άμεσων
γονιδίων στόχων του TGF-β έχει αναφερθεί, ότι ρυθμίζει τη μακρόχρονη ενεργοποίηση των
Rho GTPασών και την αναδιοργάνωση του κυτταροσκελετού της ακτίνης, όπως η α-λεία μυϊκή
ακτίνη, η RhoB GTPάση και η Net1 GEF (guanine exchange factor). Παρόλα αυτά οι
μηχανισμοί που διέπουν τη ρύθμιση της πρώιμης και καθυστερημένης ενεργοποίησης των
Rho GTPασών από τον TGF-β παραμένουν σε μεγάλο βαθμό άγνωστοι. Ο στόχος της
παρούσας μελέτης ήταν η αποσαφήνιση των μοριακών μηχανισμών που ελέγχουν τη γρήγορη
και τη μακρόχρονη ενεργοποίηση της Rho GTPάσης από τον TGF-β, καθώς και η διερεύνηση
του ρόλου τους στην αναδιοργάνωση του κυτταροσκελετού της ακτίνης και σε βιολογικές
αποκρίσεις, όπως η επιθηλιομεσεγχυματική μετατροπή (EMT) και η διεισδυτικότητα των
καρκινικών κυττάρων.
Χρησιμοποιώντας την κυτταρική σειρά χοριοκαρκινώματος JEG3, η οποία δεν εκφράζει
ενδογενώς τη Smad3, βρέθηκε ότι ο TGF-β ενεργοποιεί ταχύτατα τις RhoA και RhoB, ενώ η
αποσιώπηση της Smad2 με siRNA ή η αναστολή της φωσφορυλίωσης της μέσω του
αναστολέα του ΤβRI υποδοχέα, SB431542, δεν επηρέασε την ενεργοποίηση των RhoA/B από
τον TGF-β, υποδεικνύοντας ότι αυτή η ενεργοποίηση είναι ανεξάρτητη από τις Smad2/3.
Ακολούθως, η χρήση του γενικού αναστολέα τυροσινών Genistein ανέστειλε την
ενεργοποίηση της RhoA από τον TGF-β, υποδηλώνοντας ότι σε αυτή τη διαδικασία
εμπλέκεται η σηματοδότηση από κινάσες τυροσίνης. Προς αυτήν την κατεύθυνση η διέγερση
με TGF-β είχε ως αποτέλεσμα την ταχύτατη ενεργοποίηση της κινάσης τυροσινών Src, καθώς
και την ενεργοποίηση της GEF πρωτεΐνης Vav2 με παρόμοια κινητική. Επιπλέον, η αναστολή
της Src κινάσης με τη χρήση του αναστολέα PP2 μπλόκαρε πλήρως και η αποσιώπηση της
Vav2 με siRNA μείωσε σημαντικά την επαγόμενη από τον TGF-β ενεργοποίηση της RhoA,
υποδηλώνοντας ότι η ταχύτατη ενεργοποίηση των Src/Vav2 εμπλέκεται στο μηχανισμό της
ενεργοποίησης της RhoA από τον TGF-β.
Παράλληλα μελετήθηκε ο μηχανισμός της μακρόχρονης ενεργοποίησης της RhoA από
τον TGF-β εστιάζοντας στη ρύθμιση των ισομορφών της ειδικής για τη RhoA, Net1 GEF στα
HaCaT κερατινοκύτταρα. Ο TGF-β βρέθηκε ότι επάγει την έκφραση της ισομορφής 2 (Net1A)
και όχι την ισομορφή1 (Net1) της Net1 GEF. Η επαγωγή αυτή οδήγησε στην αύξηση των
κυτταροπλασματικών επιπέδων της Net1A, γεγονός που ήταν απαραίτητο για την
Περίληψη
II
ενεργοποίηση της RhoA από τον TGF-β. Επίσης δείχθηκε, ότι η Net1A αποτελεί άμεσο
μεταγραφικό στόχο του TGF-β και ότι η επιλεκτική έκφραση της έναντι της Net1 δεν οφείλεται
στην ενεργοποίηση κάποιου ειδικού υποκινητή, αλλά πιθανότατα στη ρύθμιση του
εναλλακτικού ματίσματος από τον TGF-β. Το Smad μονοπάτι – κυρίως η Smad3 – καθώς και
το ERK MAPK μονοπάτι δείχθηκε ότι εμπλέκονται στο μηχανισμό έκφρασης της Net1A από
τον TGF-β
Η μακρόχρονη επίδραση με TGF-β μείωσε τα επίπεδα mRNA της Net1 ισομορφής και
οδήγησε τη Net1A για αποικοδόμηση από το πρωτεόσωμα. Επιπλέον, αναγνωρίστηκαν τα
microRNAs, miR-24 και miR-155, ως νέοι μετα-μεταγραφικοί ρυθμιστές της έκφρασης της
Net1A, τα οποία επάγονται από τον TGF-β και στοχεύουν άμεσα την 3’UTR του mRNA της
Net1A (και της Net1). H αποσιώπηση και μόνο της Net1A απορύθμισε τις διακυτταρικές
συνδέσεις που μεσολαβούνται από την E-cadherin και τη ΖΟ-1 και οδήγησε στην έκφραση
των μεσεγχυματικών δεικτών N-cadherin, fibronectin, PAI-1 και του καταστολέα της Ecadherin,
Slug, ενώ ενίσχυσε το μεσεγχυματικό φαινότυπο μετά από επίδραση με TGF-β,
υποδηλώνοντας ότι η μείωση των επιπέδων της Net1A μετά από μακρόχρονη επίδραση με
TGF-β παίζει ρόλο στην επιθηλιομεσεγχυματική μετατροπή (EMT). Το miR-24 δείχθηκε επίσης
ότι εμπλέκεται στο μηχανισμό της επαγόμενης από τον TGF-β ΕΜΤ και ότι παίζει σημαντικό
ρόλο στη διεισδυτικότητα καρκινικών κυττάρων μαστού που ρυθμίζεται από τον TGF-β μέσω
στόχευσης στη Net1A. Τέλος, μετά από ανάλυση 6 ζευγών πρωτογενούς και μεταστατικού
καρκίνου του μαστού, τα επίπεδα του miR-24 βρέθηκαν αυξημένα, ενώ τα επίπεδα της Net1A
ελαττωμένα στους μεταστατικούς σε σχέση με τους πρωτογενείς όγκους, υποδηλώνοντας ότι
το μονοπάτι miR-24/Net1A ενεργοποιείται κατά τη μεταστατική διαδικασία στον καρκίνο του
μαστού
Συμπερασματικά, στην παρούσα διατριβή παρουσιάζεται ένας νέος μηχανισμός που
ρυθμίζει τη γρήγορη και παρατεταμένη αναδιοργάνωση της ακτίνης μέσω των Rho GTPασών
και ελέγχει διάφορες κυτταρικές διεργασίες, όπως η οργάνωση του κυτταροσκελετού, η ΕΜΤ
και η διεισδυτικότητα τόσο σε φυσιολογικά, όσο και σε καρκινικά κύτταρα.
|
Μελέτη της μη-γενωμικής δράσης του TGFB και ακτιβίνης σε διάφορες κυτταρικές διεργασίες που επιτελούνται στα καρκινικά κύτταρα μέσω των πρωτεινών RHO και του κυτταροσκελετού της ακτίνης
