| Περίληψη |
Το σύμπλεγμα των γονιδίων της β-σφαιρίνης του ανθρώπου με τους σύνθετους μηχανισμούς που ελέγχουν το φαινόμενο της μεταστροφής της αιμοσφαιρίνης, εξακολουθεί να αποτελεί ιδεώδες πειραματικό σύστημα για τη μελέτη του ελέγχου της γονιδιακής δραστηριότητας κατά την διάρκεια της οντογένεσης και της ερυθροποιητικής διαφοροποίησης. Eνα σημαντικό και πολύτιμο στοιχείο στην μελέτη του φαινομένου της μεταστροφής, είναι οι πολυάριθμες μεταλλάξεις από ποικίλα ελλείμματα του συμπλέγματος που οδηγούν στην εμφάνιση συγκεκριμένων κλινικών συνδρόμων που συνοδεύονται από την αυξημένη και συνεχή παραγωγή εμβρυϊκής αιμοσφαιρίνης στην ενήλικο ζωή. Mελέτες από τα προκύπτοντα δύο διάκριτα σύνδρομα, ήτοι τη δβ-θαλασσαιμία και την κληρονομική παραμονή της εμβρυϊκής αιμοσφαιρίνης (hereditary persistence of fetal hemoglobin ή HPFH) έχουν εντοπίσει στο σύμπλεγμα διάφορες cis-ρυθμιστικές αλληλουχίες που τροποποιούν την έκφραση των επιμέρους γονιδίων της σφαιρίνης. H ανακάλυψη αυτών των cis αλληλουχιών έχει βοηθήσει στην κατανόηση ορισμένων φαινομένων της γονιδιακής έκφρασης και της μεταστροφής της αιμοσφαιρίνης. Σκοπός της παρούσας Διατριβής ήταν να ελεγχθούν πειραματικά οι σημερινές δύο υποθέσεις που έχουν διατυπωθεί για να εξηγήσουν τους φαινοτύπους της δβ-θαλασσαιμίας και της HPFH (δηλ. της διαμετάθεσεις ενισχυτών ή/και της αφαίρεσης αποσιωπητών), μέσω της ανίχνευσης νέων cis-ρυθμιστικών αλληλουχιών στο σύμπλεγμα της β-σφαιρίνης που τροποποιούν την έκφραση των γ-γονιδίων σε αυτές τις μεταλλάξεις και ενδεχομένως συμμετέχουν στο φαινόμενο της μεταστροφής της αιμοσφαιρίνης. Οι μελέτες είχαν ως αποτέλεσμα την ανακάλυψη μιας σειράς νέων στοιχείων ενισχυτών και αποσιωπητών. Ανιχνεύτηκαν δύο νέοι ενισχυτές 3Ά των ελλειμάτων της HPFH-3 και HPFH-6, καθώς και τέσσερις αποσιωπητές, δύο 3Ά του Αγ-γονιδίου και δύο 5Ά του δ-γονιδίου. Στο πρώτο μέρος της Διατριβής διερευνήθηκε η αξία της υπόθεσης ότι η αύξηση στην έκφραση των γ-γονιδίων οφείλεται στη διαμετάθεση ενισχυτών από το 3Ά άκρο του συμπλέγματος σε γειτνίαση με τα γ-γονίδια. Για τον σκοπό αυτό, αρχικά μελετήθηκε in vivo το γεφυρικό τμήμα της μετάλλαξης HPFH-3 που αποτελείται από το εμβρυϊκό Αγ-γονίδιο και περίπου 6.2 kb αλληλουχιών από το 3Ά άκρο του συμπλέγματος. Δύο ποντίκια παρουσίασαν παρατεταμένη έκφραση του Αγ-γονίδιου τόσο στον λεκιθικό ασκό όσο και στο εμβρυϊκό ήπαρ. Η έκφραση αυτή ευρίσκεται σε αντίθεση με το πρότυπο έκφρασης των Αγ-γονιδίων όταν εισάγονται χωρίς επιπρόσθετες αλληλουχίες και εκφράζονται μόνο στην πρώϊμο εμβρυϊκή ζωή. Με εκτεταμένες λειτουργικές δοκιμασίες CAT τόσο σε ερυθροποιητικά κύτταρα Κ562 όσο σε μη-ερυθροποιητικά κύτταρα HeLa εντοπίσαμε τον ενισχυτή σε τμήμα μήκους 0.7 kb αμέσως μετά το 3Ά σημείο αποκοπής της HPFH-3. Ο ενισχυτής της HPFH-3 ελέγχθηκε περαιτέρω για την οντογενετική του εξειδίκευση σε υποκινητές ετερόλογων γονιδίων της σφαιρίνης (ε, δ και β) καθώς και στον μη-ετερόλογο υποκινητή της διϋδροφυλικής αφυδρογονάσης (DHFR). Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η δράση του ενισχυτή της HPFH-3 περιορίζεται κυρίως στον υποκινητή του όψιμου εμβρυϊκού γονιδίου. Η ανάλυση της πρωτοταγούς δομής του ενισχυτή έδειξε ότι περιέχει ένα σύμπλεγμα από επαναληπτικές αλληλουχίες που παριστά μέρος μιας μακράς τελικής επαναληπτικής αλληλουχίας (LTR) ενός ενδογενούς ρετροϊού της οικογένειας ERV-9, που παρουσιάζει ομολογία με ένα δεύτερο στοιχείο ERV-9 με παρόμοια δράση ενισχυτού και εντοπίζεται 5Ά της περιοχής LCR. Η αντίστοιχη περιοχή ERV-9 είναι παρούσα και στο DNA του γίββονα, του ουραγκουτάγκου και του γορίλλα. Η δομική ανάλυση επεκτάθηκε περαιτέρω κατά 5,337 bp ολοκληρώνοντας έτσι την ανάλυση της διαμετατιθέμενης περιοχής των 6,261 bp που είχε ελεγχθεί λειτουργικά. Η ανάλυση της περιοχής εντόπισε πολλαπλές δυνητικές θέσεις δέσμευσης για διάφορους μεταγραφικούς παράγοντες, πολλαπλά ανοικτά μεταγραφικά πλαίσια (ORFs) καθώς και μία νέα αλληλουχία τύπου Mammalian apparent LTR-Retrotransposons (MaLRs) η οποία εμφανίζει δομικές ομοιότητες προς τους ενδογενείς ρετροϊούς. Στη συνέχεια μελετήθηκαν δομικά και λειτουργικά άλλες δύο μεταλλάξεις, η HPFH-4 και η Γερμανική (Αγδβ)ο θαλασσαιμία. Οι μεταλλάξεις αυτές είναι συγκρίσιμες τόσο στα σημεία αποκοπής όσο και στο μέγεθος τους εν σχέσει με την HPFH-3. Με λειτουργικές δοκιμασίες τόσο σε Κ562 όσο και σε HeLa κύτταρα, αποκλείστηκε η παρουσία ενός νέου ενισχυτή στην διαμετατιθέμενη περιοχή 2,255 bp που βρίσκεται ανοδικά του 3Ά σημείου αποκοπής του ελλείμματος της HPFH-3. Τα ανωτέρω αποτελέσματα τεκμηριώνουν ότι η ενεργοποίηση των εμβρυϊκών γ-γονιδίων στις τρεις συγκρίσιμες μεταλλάξεις, δημιουργείται από ένα κοινό ρυθμιστικό μηχανισμό μέσω του ενισχυτή της HPFH-3. Περαιτέρω, με κυτταρικά υβρίδια MEL μελετήθηκαν in vivo οι μηχανισμοί που οδηγούν στην ενεργοποίηση των εμβρυϊκών γονιδίων cis των ελλειμμάτων αυτών in vivo. Υβρίδια με το έλλειμμα της Γερμανικής (Αγδβ)ο θαλασσαιμίας x MEL εξέφρασαν γ-σφαιρίνη κατανεμημένη σε 2-3% των κυττάρων, αποτέλεσμα που ευρίσκεται σε αντίθεση με προηγούμενη μας μελέτη όπου στα κυτταρικά υβρίδια HPFH-1 και HPFH-2 x MEL η κατανομή της γ-σφαιρίνης ήταν πανκυτταρική. Η διαφορά που παρατηρείται στην έκφραση των γ-γονιδίων στα δύο σύνδρομα, οφείλεται όπως πρόσφατα αποδείξαμε, στην παρουσία ενός δεύτερου νέου μεταγραφικού ενισχυτή 3Ά του ελλείμματος της HPFH-2, καθώς και στην διαφορά ισχύος μεταξύ των δύο διαμετατιθέμενων ενισχυτών (HPFH-1 έναντι HPFH-3). Στη συνέχεια ελέγξαμε λειτουργικά την 3Ά διαμετατιθέμενη περιοχή σε άλλες δύο μεταλλάξεις, την Ολλανδική (β)ο και την Ισπανική (δβ)ο θαλασσαιμία. Λειτουργικές δοκιμασίες CAT σε κύτταρα Κ562 και κύτταρα HeLa απέκλεισαν την παρουσία ενισχυτή στις διαμετατιθέμενες περιοχές τους. Επομένως, η ενεργοποίηση των γ-γονιδίων σε αυτές τις μεταλλάξεις θα πρέπει να δημιουργείται μέσω άλλου μηχανισμού. Δεδομένου ότι η διαμετατιθέμενη περιοχή της Ισπανικής (δβ)ο θαλασσαιμίας επεκτείνεται πέρα από το 3Ά άκρο των περισσότερων μεταλλάξεων, προχωρήσαμε στην δομική της ανάλυση. Η ανάλυση της αλληλουχίας μήκους 3,077 bp, έδειξε ότι η περιοχή περιέχει κυρίως πολλαπλές επαναλληπτικές αλληλουχίες των οικογενειών LINE 1 και Alu. Συγχρόνως ελέγξαμε λειτουργικά την 3Ά διαμετατιθέμενη περιοχή σε άλλες δύο συγκρίσιμες μεταλλάξεις, την Κινεζική και την Ταϋλανδική (Αγδβ)ο θαλασσαιμία. Τα αποτελέσματα μας μετά από διαμόλυνση σε κύτταρα Κ562, έδειξαν ότι ένα τμήμα αμέσως μετά από το σημείο αποκοπής της Ταϋλανδικής (Αγδβ)ο θαλασσαιμίας, βρέθηκε να ενισχύει την δραστικότητα της CAT κατά 5-6 φορές. Σημαντικό ενδιαφέρον παρουσιάζει το γεγονός ότι η αφαίρεση του ενισχυτή στη περίπτωση της Κινεζικής (Αγδβ)ο θαλασσαιμίας, οδηγεί σε φαινότυπο (δβ)ο θαλασσαιμίας, ενώ η διατήρηση του στην Ταϋλανδική (Αγδβ)ο θαλασσαιμία οδηγεί σε φαινότυπο HPFH. Με βάση τα ανωτέρω, προτείναμε η Ταϋλανδική (Αγδβ)ο θαλασσαιμία να μετονομασθεί σε HPFH-6. Στη συνέχεια, ο ενισχυτής HPFH-6 ελέγχθηκε για την οντογενετική του εξειδίκευση σε υποκινητές ετερόλογων γονιδίων της σφαιρίνης (ε, δ και β) καθώς και στον μη-ετερόλογο υποκινητή της DHFR. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η δράση του ενισχυτή της HPFH-6 περιορίζεται στον υποκινητή του όψιμου εμβρυϊκού γονιδίου. Η δομική ανάλυση του ενισχυτού, συνολικού μήκους 1,476 bp απεκάλυψε την ύπαρξη πολλαπλών θέσεων αναγνώρισης για διάφορους μεταγραφικούς παράγοντες. Μία σειρά προοδευτικών μεταλλάξεων-ελλειμμάτων του ενισχυτή, έδειξαν σε κύτταρα Κ562 ότι μειώνουν σημαντικά την δραστικότητα του, γεγονός που υποδηλώνει τη συνεργιστική δράση και αλληλεπίδραση των επί μέρους παραγόντων για την πλήρη δραστικότητα του ενισχυτή. Η δομική ανάλυση επεκτάθηκε καθοδικά έως και μετά το σημείο αποκοπής της Κινεζικής (Αγδβ)ο θαλασσαιμίας. Η ανάλυση, συνολικής έκτασης 3,157 bp, έδειξε ότι το 3Ά άκρο αποκοπής της HPFH-6 εντοπίζεται 2,809 bp ανοδικά από το 3Ά άκρο της Κινεζικής (Αγδβ)ο θαλασσαιμίας. Ακολούθησε επεξεργασία της αλληλουχίας του ενισχυτή και εντοπίστηκε ένα ORF 230 αμινοξέων που αποτελεί μέρος ενός γονιδίου που κωδικοποιεί για υποδοχέα του οσφρητικού βολβού (olfactory receptor ή OR). Ενδιαφέρον παρουσιάζει το γεγονός ότι άλλο ένα παρόμοιο γονίδιο με 37% ομολογία σε επίπεδο αμινοξέων, εντοπίζεται εντός του ενισχυτή 3Ά της HPFH-1, ενώ αλλά τρία OR γονίδια εντοπίζονται στην 5Ά περιοχή της LCR ο ρόλος τον οποίων ακόμα δεν έχει διευκρινιστεί. Η έκφραση του HPFH-6 OR γονιδίου (OR-6H) αναλύθηκε με την αντίστροφη μεταγραφή του mRNA, όπου βρέθηκε ότι εκφράζεται σε διάφορες αιμοποιητικές σειρές (Κ562, MEL και HL60). Αρνητική ήταν η ανάλυση κατά Northern λόγω των χαμηλών επιπέδων της έκφρασης. Ακολούθως, ελέγχθηκε με PCR, μία cDNA βιβλιοθήκη από ανθρώπινο ιστό οσφρητικού βολβού, όπου όμως δεν προέκυψε κανένα προϊόν PCR, υποδηλώντας ότι το OR-6H είτε δεν εκφράζεται σε αυτή την βιβλιοθήκη, είτε ότι αντιπροσωπεύει μια υποκατηγορία OR γονιδίων που εκφράζονται ειδικά στίς ανωτέρω κυτταρικές σειρές. Στο δεύτερο μέρος της Διατριβής, διερευνήθηκε η αξία της δεύτερης υπόθεσης για την δημιουργία των φαινοτύπων δβ-θαλασσαιμίας και HPFH που αφορά την αφαίρεση λόγω ελλείματος, αρνητικών cis-ρυθμιστικών αλληλουχιών ή αποσιωπητών που εδράζονται μεταξύ των Αγ και δ-γονιδίων. Εκτεταμένες λειτουργικές δοκιμασίες CAT και λουσιφεράσης στην περιοχή 13.4 kb μεταξύ των Αγ και δ-γονιδίων, απεκάλυψαν την παρουσία τεσσάρων τμημάτων με ιδιότητες αποσιωπητού. Η δραστικότητα των πλασμιδίων που περιείχαν τις περιοχές αυτές ήταν κατά 30-40% χαμηλότερη του πλασμιδίου αναφοράς. Δύο τμήματα (Enh και F) εντοπίσθηκαν 0.4 kb και 1.6 kb από το 3Ά άκρο του Αγ-γονιδίου, αντίστοιχα, ενώ δύο άλλα τμήματα (Ο και Ρ) εντοπίσθηκαν 2.3 και 0.7 kb 5Ά του δ-γονιδίου, αντίστοιχα. Τα αποτελέσματα αυτά είναι συμβατά με τα δεδομένα σε διαγονιδιακά ποντίκια τα οποία έδειξαν αυτόνομη καταστολή των γ-γονιδίων αμέσως μετά την γέννηση σε κατασκευές DNA που περιείχαν τις αλληλουχίες Enh και F. Περαιτέρω μελετήσαμε τους παράγοντες που συνδέονται με τον αποσιωπητή F. Η ανάλυση έδειξε ότι το τμήμα F μήκος 364 bp συνδέεται σε έξι θέσεις με τον παράγοντα ΥΥ1 με διαφορετική ισχύ. Στην συνέχεια δημιουργήθηκε μία σειρά από μεταλλάξεις στις τρεις ισχυρές θέσεις σύνδεσης (26, 108 και 311) του παράγοντα ΥΥ1. Λειτουργικές δοκιμασίες λουσιφεράσης έδειξαν ότι μόνο η μετάλλαξη στην ΥΥ1 θέση 108 αναστέλλει τη δράση του αποσιωπητή, γεγονός που υποδηλώνει ότι αποτελεί σημαντική παράμετρο για τη δράση του. Στην τελευταία μελέτη διερευνήθηκε περαιτέρω ο ρόλος των αποσιωπητών Ο και Ρ στη δημιουργία του φαινοτύπου δύο συγκρίσιμων μεταλλάξεων, της Αμερικανικής (δβ)ο θαλασσαιμία και της Ιταλικής HPFH-5. Τα γεφυρικά τμήματα των δύο μεταλλάξεων καθώς και μία σειρά αλληλοκαλυπτομένων τμημάτων από τις περιοχές των σημείων αποκοπής ελέγχθηκαν με δοκιμασίες CAT τόσο σε κύτταρα Κ562 όσο και σε κύτταρα COS-7. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι το γεφυρικό τμήμα της HPFH-5, που περιλαμβάνει ένα μικρό τμήμα του κολοβωμένου αποσιωπητού Ο σε σύντηξη με ένα σχεδόν άθικτο τμήμα του ενισχυτού που βρίσκεται 3Ά του β-γονιδίου, αύξησε την δραστικότητα CAT κατά 4-5 φορές. Αντίθετα, το συγκρίσιμο γεφυρικό τμήμα της Αμερικανικής (δβ)ο θαλασσαιμίας, που περιέχει ένα άθικτο τμήμα του αποσιωπητού Ο σε σύντηξη με ένα άθικτο τμήμα του ενισχυτού 3Ά του β-γονιδίου παρουσίασε δραστικότητα χαμηλότερη του πλασμιδίου αναφοράς γ-CAT. Στη συνέχεια δημιουργήσαμε προοδευτικά ελλείμματα επί του γεφυρικού τμήματος της Αμερικανικής (δβ)ο θαλασσαιμίας στην θέση του αποσιωπητού Ο. Η αφαίρεση της εσωτερικής αλληλουχίας οδήγησε στην επανενεργοποίηση του γ-CAT γονιδίου κατά τέσσερις φορές. Τα αποτελέσματα αυτά μιμούνται επαρκώς την in vivo κατάσταση και τεκμηριώνουν την άποψη ότι η διατήρηση και η παρουσία του αποσιωπητή Ο είναι υπεύθυνη για τις φαινοτυπικές διαφορές μεταξύ των δύο ελλειμμάτων. Με βάση τα ανωτέρω αποτελέσματα, βρίσκεται σε εξέλιξη η in vivo ανάλυση των νέων cis-ρυθμιστικών στοιχείων ως προς την έκφραση των γ-γονιδίων. H απόκτηση νέων γνώσεων που προέκηψαν από την παρούσα Διατριβή, όσον αφορά τους μηχανισμούς της μεταστροφής, αναμένεται να οδηγήσει όχι μόνο στην καλύτερη ερμηνεία των βασικών βιολογικών ερωτημάτων που σχετίζονται με τη γονιδιακή έκφραση, αλλά και στην δυνατότητα ανάπτυξης νέων μεθόδων γονιδιακής θεραπείας με την ενσωμάτωση των ανωτέρω στοιχείων σε κατασκευές ρετροϊών ή/και την αδρανοποίηση των αποσιωπητών με ομόλογο ανασυνδυασμό, με στόχο την αποτελεσματική και οριστική θεραπεία σοβαρών κληρονομικών νόσων όπως είναι η β-θαλασσαιμία και η δρεπανοκυτταρική αναιμία.
|
Μελέτη των cis-ρυθμιστικών στοιχείων του συμπλέγματος των γονιδίων της β-σφαιρίνης του ανθρώπου που συμμετέχουν στην αναπτυξιακή ρύθμιση των εμβρυϊκών γ-γονιδίων
