|
|
| Κωδικός Πόρου |
000334467 |
| Τίτλος |
Μελέτη του σηματοδοτικού μοναπατιού του μετασχηματίζοντα αυξητικού παράγοντα β (TGF-β) in vivo, με χρήση ανασυνδυασμένων αδενοϊών |
| Άλλος τίτλος |
Study of the TGF-β signaling pathway in vivo, using recombinant adenoviruses |
|
Συγγραφέας
|
Σκούρτη-Σταθάκη, Κωνστντίνα
|
|
Σύμβουλος διατριβής
|
Καρδάσης, Δημήτριος
|
| Περίληψη |
Ο TGF-β (transforming growth factor-β) αποτελεί έναν σημαντικό αναστολέα της ανάπτυξης των επιθηλιακών κυττάρων και ανήκει στη μεγάλη υπερ-οικογένεια των πλειοτροπικών κυτοκινών που ρυθμίζουν ποικίλες βιολογικές διαδικασίες κατά τη διάρκεια της ανάπτυξης και της ομοιόστασης των ενήλικων ιστών. Ο TGF-β σηματοδοτεί μέσω μεμβράνικών υποδοχέων με δραστικότητα κινάσης Ser/Thr, οι οποίοι
μεταδίδουν το σήμα μέσω ενδοκυττάριων μορίων Smad2, Smad3 και Smad4. Οι πρωτεΐνες Smad περιέχουν συντηρημένες MH1 και ΜΗ2 επικράτειες (domains), που χωρίζονται μεταξύ τους από μια ευέλικτη linker επικράτεια. Τα σύμπλοκα των Smads ρυθμίζουν τη γονιδιακή έκφραση και καθορίζουν τη βιολογική απόκριση στον TGF-β.
Τελευταία δεδομένα δείχνουν ότι η επικράτεια linker της Smad3 περιέχει μια περιοχή μεταγραφικής ενεργοποίησης. Η περιοχή αυτή είναι ικανή να στρατολογήσει τον μεταγραφικό συνενεργοποιητή p300 και είναι απαραίτητη για τη μεταγραφική ενεργοποίηση μέσω Smad3. Η κατασκευή και ταυτοποίηση μεταλλαγών, από το εργαστήριο μας σε προηγούμενη μελέτη, στην περιοχή του linker της Smad3, στα
συντηρημένα κατάλοιπα Ρ229 και Q222 οδήγησαν στο συμπέρασμα ότι οι μεταλλαγές αυτές έχουν κατασταλτικό ρόλο στο μόριο της Smad3. Ένας από τους στόχους μας ήταν η μελέτη των μεταλλαγών αυτών in vivo και επομένως η μεταφορά των μεταλλαγμένων μορφών της Smad3 σε ευκαρυωτικά κύτταρα με τη χρήση ανασυνδυασμένων αδενοϊών. Για τον καθορισμό του ρόλου των μεταλλαγών στη Smad3 in vivo, έγινε μελέτη της μεταγραφής δύο γονιδίων-στόχων του μονοπατιού του TGF-β, των ΡΑΙ-1 (Plasminogen Activator Inhibitor-1) και p21 (CDKN1A), παρουσία αδενοϊών που φέρουν τις μεταλλαγμένες μορφές Smad3(P229A) και Smad3(Q222A). Δείξαμε ότι ο ιός
AdSmad3(P229A)-6myc καταστέλλει την ενεργοποίηση της μεταγραφής των γονιδίων στόχων του μονοπατιού του ΤGF-β, σε συνθήκη προσθήκης ΤGF-β για 1h και σε συνθήκη προσθήκης του ιού AdALK5ca.
Δεύτερος στόχος της εργασίας ήταν η ανάπτυξη ενός συστήματος βιοτινυλίωσης πρωτεινών in vivo κάνοντας χρήση ανασυνδυασμέων αδενοϊών με σκοπό τη μελέτη πρωτεϊνικών αλληλεπιδράσεων σε ζωντανούς οργανισμούς. Για το σκοπό αυτό κατασκευάσαμε ανασυνδυασμένους αδενοϊούς που εκφράζουν την πρωτείνη Smad3bio
2 (που φέρει την αγρίου τύπου Smad3 σε σύντηξη με τον επίτοπο Bio) και τη λιγάση βιοτίνης BirA και δείξαμε ότι με το σύστημα αυτό μπορεί να επιτευχθεί βιοτινυλίωση της Smad3 σε κύτταρα HaCaT.
Ο τρίτος ερευνητικός σκοπός της εργασίας αυτής ήταν η μελέτη της ρύθμισης και της λειτουργίας ενός καινούριου άμεσου στόχου του μονοπατιού του ΤGF-β, του γονιδίου BCAR3 (Breast Cancer Anti-estrogen Resistance 3). Πραγματοποιήθηκαν πειράματα μελέτης της μεταγραφής του γονιδίου BCAR3 και μελέτη μεταγραφικής
ενεργοποίησης του υποκινητή του γονιδίου BCAR3, παρουσία συστατικών του μονοπατιού του ΤGF-β. Δείξαμε ότι η μεταγραφή του γονιδίου BCAR3 αυξάνεται σημαντικά μετά από προσθήκη του ΤGF-β σε κύτταρα HaCaT. Η ενεργοποίηση αυτή φαίνεται να είναι υψηλότερη όταν ο ΤGF-β προστίθεται για 3h. Η αύξηση αυτή ήταν πολύ χαμηλότερη όταν το πείραμα διεξήχθησε σε κύτταρα HepG2. Επίσης, η μεταγραφή του γονιδίου BCAR3 αυξάνεται σηματικά μετά από προσθήκη του αναδυνδυασμένου αδενοϊού AdALK5 σε κύτταρα HaCaT. Τέλος, βρέθηκε ότι ο υποκινητής του γονιδίου
BCAR3 ενεργοποιείται σημαντικά παρουσία του συστατικά ενεργού υποδοχέα caALK5 και των μεταγραφικών παραγόντων Smad3 και Smad4 σε κύτταρα ΗΕΚ293Τ και HepG2.
Ο ΤGF-β παίζει πολύ σημαντικό ρόλο κατά τη διάρκεια της ανάπτυξης και στον ενήλικο οργανισμό ρυθμίζοντας την ομοιόσταση σε διάφορους ιστούς. Στην ανάπτυξη του καρκίνου, ο ΤGF-β παίζει διπλό ρόλο: είναι καταστολέας της ογκογένεσης σε φυσιολογική κατάσταση και επαγωγέας της ογκογένεσης σε προχωρημένη καρκινική
κατάσταση. Τα δεδομένα μας για καταστολή του μορίου της Smad3 in vivo από τη μεταλλαγή Ρ229Α στην περιοχή του linker αποτελούν χρήσιμη γνώση για την ανάπτυξη νέων θεραπευτικών εργαλείων για τη θεραπεία του καρκίνου σε περιπτώσεις υπερλειτουργίας του μονοπατιού του ΤGF-β. Επιπρόσθετα, η επιβεβαίωση ότι το γονίδιο
BCAR3 ρυθμίζεται και ενεργοποιείται από το μονοπάτι του ΤGF-β αποτελεί σημαντική γνώση για τη μελέτη της λειτουργίας του γονιδίου καθώς και για περαιτέρω σχεδιασμό νέων στρατηγικών στη θεραπεία του καρκίνου.
|
| Φυσική περιγραφή |
99 σ. : εικ. ; 30 εκ. |
| Γλώσσα |
Ελληνικά |
| Θέμα |
BCAR Breast Cancer Anti-estrogen Resistance |
|
PAI Plasminogen Activator Inhibitor |
|
Smad |
|
ευκαρυωτικά κύτταρα |
| Ημερομηνία έκδοσης |
2008-12-04 |
| Συλλογή
|
Σχολή/Τμήμα--Σχολή Θετικών και Τεχνολογικών Επιστημών--Τμήμα Βιολογίας--Μεταπτυχιακές εργασίες ειδίκευσης
|
|
|
Τύπος Εργασίας--Μεταπτυχιακές εργασίες ειδίκευσης
|
| Σημειώσεις |
Διατμηματικό πρόγραμμα μεταπτυχιακών σπουδών:" Μοριακή Βιολογία - Βιοϊατρική" |
| Εμφανίσεις |
289 |
Μελέτη του σηματοδοτικού μοναπατιού του μετασχηματίζοντα αυξητικού παράγοντα β (TGF-β) in vivo, με χρήση ανασυνδυασμένων αδενοϊών
