| Περίληψη |
Το εντεροπαθογόνο Ε. coli (EPEC) είναι ένα κατά Gram αρνητικό βακτήριο το οποίο προσβάλλει το εντερικό επιθήλιο και αποτελεί απειλή για την υγεία των ανθρώπων κυρίως στις αναπτυσσόμενες χώρες. Υπεύθυνο κατά κύριο λόγο, για την παθογονικότητα του βακτηρίου είναι ένα μοναδικό σύστημα έκκρισης πρωτεϊνών, το σύστημα έκκρισης Τύπου ΙΙΙ (T3S). Το T3S είναι μια περίπλοκη νανομηχανή μέσω της οποίας εκκρίνονται απευθείας στο κύτταρόπλασμα του ξενιστή όλες οι μολυσματικές πρωτεΐνες του βακτηρίου. Η νανομηχανή αυτή αποτελείται από το βασικό σωμάτιο, που διαπερνά τις βακτηριακές μεμβράνες, από την βελόνη και το ινίδιο, εξωκυτταρικά. Παρόλες τις μελέτες που έχουν γίνει γύρω από το σύστημα έκκρισης αυτό, τόσο δομικά όσο και λειτουργικά, πολλά ερωτήματα παραμένουν αναπάντητα.
Στην παρούσα διατριβή, προσπαθούμε αρχικά να ανιχνεύσουμε το σύνολο των πρωτεϊνών οι οποίες εκκρίνονται διαμέσου του T3S από τα EPEC. Στην συνέχεια, σε μια προσπάθεια να κατανοήσουμε το μονοπάτι έκκρισης των μολυσματικών πρωτεϊνών, μελετάμε τον τρόπο έκκρισης των μεταθέτων EspA και EspB και τις αλληλεπιδράσεις αυτών με την σαπερόνη τους, CesAB.
Για την επίτευξη του σκοπού αυτού, αρχικά προσδιορίσαμε τις συνθήκες στις οποίες η έκκριση των πρωτεϊνών είναι βέλτιστη. Στη συνέχεια, ανιχνεύσαμε το σύνολο των πρωτεϊνών το οποίο εκκρίνεται διαμέσου του T3S, χρησιμοποιώντας την μέθοδο της φασματομετρίας μάζας. Τέλος, αξιοποιώντας γενετικά τροποποιημένα στελέχη EPEC, προσδιορίσαμε την ιεραρχία με την οποία εκκρίνονται οι μολυσματικοί παράγοντες από τα αγρίου τύπου κύτταρα, και το πως η ιεραρχία αυτή επηρεάζεται απουσία πρωτεϊνών οι οποίες ρυθμίζουν την έκκριση.
Παράλληλα, προσπαθήσαμε να διερευνήσουμε τον τρόπο που αλληλεπιδρούν οι μολυσματικές πρωτεΐνες με τις εξειδικευμένες σαπερόνες του συστήματος έκκρισης τύπου ΙΙΙ, χρησιμοποιώντας σαν μοντέλο τους μετάθετες EspA και EspB και την σαπερόνη αυτών CesAB. Για τον λόγο αυτό, πραγματοποιήσαμε βιοχημικά πειράματα τόσο in vitro όσο και ex vivo. Στα πειράματα αυτά, μελετήσαμε τις αλληλεπιδράσεις της σαπερόνης και των υποστρωμάτων της, καθώς και πώς αυτές οι αλληλεπιδράσεις επηρεάζονται από διάφορα γενετικά τροποποιημένα παράγωγα της σαπερόνης.
Επιπλέον, σε μια προσπάθεια να κατανοήσουμε το μονοπάτι της στόχευσης που ακολουθούν οι πρωτεΐνες EspA και EspB πριν την έκκρισή τους από το T3S, ανιχνεύσαμε τα τεταρτοταγή σύμπλοκα που δημιουργούνται στα διαφορετικά υπό-κυτταρικά κλάσματα που δημιουργούνται έπειτα από ήπια και έντονη διάρρηξη των κυττάρων EPEC. Τέλος, αναλύσαμε τους παράγοντες από τους οποίους τα μεγαλομοριακά αυτά σύμπλοκα αποτελούνται, χρησιμοποιώντας φασματομετρία μάζας.
Τα αποτελέσματα της εργασίας αυτής αποτελούν μια βάση για την κατανόηση του μοριακού μηχανισμού έκκρισης των πρωτεϊνών από το T3S των EPEC και στοιχειοθετούν ένα πλαίσιο για την περαιτέρω ανάλυση του μονοπατιού έκκρισης των πρωτεϊνών από το σύστημα αυτό.
|
Μοριακή ανάλυση του μηχανισμού έκκρισης τύπου ΙΙΙ στο εντεροπαθογόνο E.coli
