| Περίληψη |
Η RNA σίγηση (RNA silencing) αναφέρεται στη μεσολάβηση RNA μορίων σε
μηχανισμούς που ρυθμίζουν τη γονιδιακή έκφραση, οδηγώντας είτε στον
κατακερματισμό των αντίστοιχων μεταγράφων είτε στην παρεμπόδιση της
μετάφρασής τους. Αν και ο μηχανισμός της σίγησης περιλαμβάνει διαφορετικά
μονοπάτια, που διακρίνονται με βάση τη λειτουργία τους και τις εμπλεκόμενες
πρωτεΐνες, κοινό χαρακτηριστικό αποτελεί η παραγωγή μικρών RNAs (sRNAs) μήκους
20-24 νουκλεοτιδίων από τις Dicer-like (DCL) πρωτεΐνες. Στο φυτό-μοντέλο Nicotiana
benthamiana (N. benthamiana) υπάρχουν τέσσερις DCL πρωτεΐνες, που η κάθε μία
παράγει μικρά RNAs συγκεκριμένου μήκους, τα οποία εμπλέκονται σε συγκεκριμένα
μονοπάτια. Η μελέτη του ρόλου των πρωτεϊνών αυτών παρουσιάζει μεγάλο
ενδιαφέρον. Με σκοπό την πλήρη καταστολή των DCL γονιδίων, επιλέχθηκε το
πρόσφατα ανεπτυγμένο σύστημα CRISPR/Cas9. Ως εργαλείο γονιδιακής
τροποποίησης, το σύστημα CRISPR/Cas9 περιλαμβάνει την ενδονουκλεάση Cas9 και
ένα ενιαίο μόριο RNA-οδηγό (single-guide RNA), το οποίο παρουσιάζει ομολογία με
την αλληλουχία-στόχο και κατευθύνει την Cas9 προκειμένου να προκληθούν
δίκλωνες θραύσεις στο DNA.
Για τους σκοπούς της εργασίας στο παρελθόν σχεδιάστηκαν πλασμίδια για την
έκφραση RNA-οδηγών που στοχεύουν στα γονίδια των DCL (DCL2, DCL3, DCL4) σε
συγκεκριμένες περιοχές, καθώς αποκτήθηκε και πλασμίδιο που εκφράζει την Cas9.
Τα πλασμίδια χρησιμοποιήθηκαν για τη δημιουργία διαγονιδιακών φυτών και στη
συνέχεια μέσω διασταυρώσεων αποκτήθηκαν φυτά που εκφράζουν ταυτόχρονα την
Cas9 και ένα ή δύο RNA-οδηγούς που στοχεύουν στο γονίδιο μιας συγκεκριμένης DCL.
Μετά την απόκτηση των φυτών, ακολουθεί η ανίχνευση και η ανάλυση των
προκληθέντων μεταλλαγών σε φυτά της επόμενης γενιάς.
Μέσω της ανάλυσης που είχε ήδη πραγματοποιηθεί τα προηγούμενα χρόνια στο
εργαστήριο, σε συνδυασμό με τα αποτελέσματα της παρούσας εργασίας, έχει
επιτευχθεί η απόκτηση φυτών με γενετικές τροποποιήσεις στα γονίδια των DCL2,
DCL3 και DCL4. Για τη DCL3 έχει ολοκληρωθεί η δοκιμή λειτουργικότητας με βάση τον
έλεγχο παραγωγής μικρών RNAs 24nt, ενώ έχουν αποκτηθεί φυτά ομόζυγα για
μεταλλαγή που οδηγεί σε πλήρη καταστολή της λειτουργίας της DCL3. Για τη DCL2 η
ανάλυση έχει προχωρήσει μέχρι τη δοκιμή λειτουργικότητας, όπου έχουν εντοπιστεί
πιθανά φυτά με απουσία παραγωγής μικρών RNAs 22nt. Τέλος, για τη DCL4
αναμένεται να πραγματοποιηθεί η δοκιμή λειτουργικότητας, για τον εντοπισμό
φυτών με απουσία παραγωγής μικρών RNAs 21nt.
Τα φυτά με πλήρη καταστολή των DCL γονιδίων θα πρέπει μελλοντικά να συγκριθούν
με τα αντίστοιχα φυτά που παρουσιάζουν μερική καταστολή των DCL γονιδίων μέσω
RNAi. Έτσι, στα φυτά αυτά (DCLi φυτικές σειρές), καθώς και σε φυτά που προκύπτουν
από τη διασταύρωσή τους, μελετήθηκε η μολυσματικότητα του ιού CMV. Οι μελέτες
αυτές θα αποτελέσουν πρότυπο σύγκρισης για τα φυτά με πλήρη καταστολή των DCL
γονιδίων.
Στα πλαίσια της σύγκρισης φυτών με μερική και πλήρη καταστολή, τα ομόζυγα φυτά
με πλήρη καταστολή του γονιδίου της DCL3 επιλέχθηκαν να χρησιμοποιηθούν σε
πειράματα μελέτης μολυσματικότητας ιών και ιοειδών. Στην παρούσα εργασία
περιγράφεται η προσπάθεια σύγκρισης των επιπέδων μολυσματικότητας του
ιοειδούς PSTVd (Potato Spindle Tuber Viroid) σε φυτά με μερική και πλήρη καταστολή
του γονιδίου της DCL3.
Συνοψίζοντας, η παρούσα εργασία αποτελεί μέρος της διαδικασίας που θα οδηγήσει
στη δημιουργία φυτών με μεταλλαγές απώλειας λειτουργίας στα DCL γονίδια. Τα
φυτά αυτά θα αποτελέσουν ένα πολύ χρήσιμο εργαλείο για τη μελέτη του ρόλου των
DCL πρωτεϊνών, ιδιαίτερα στην περίπτωση ιικών μολύνσεων.
|
Χρήση του συστήματος CRISPR/Cas9 για τη δημιουργία φυτών Nicotiana benthamiana με πλήρη καταστολή των DCL γονιδίων
