| Περίληψη |
Ο παράγοντας ERF (ETS2 Repressor Factor) είναι ένας ευκαρυωτικός μεταγραφικός ογκοκαταστολέας κι έχει δειχτεί να εμπλέκεται τόσο στην εμβρυική ανάπτυξη του ποντικού όσο και στην ανθρώπινη παθολογία στην περίπτωση της σχετιζόμενης με τον ERF κρανιοσυνόστωσης. Η δράση του ERF στο κύτταρο ρυθμίζεται κυρίως μέσω της φωσφορυλίωσής του από τις κινάσες ERK (Extracellular signal- Regulated Kinases), η οποία λαμβάνει χώρα στον πυρήνα παρουσία εξωκυττάριου μιτογόνου ερεθίσματος και έχει ως αποτέλεσμα την άμεση έξοδο του ERF προς το κυτταρόπλασμα και τη μετέπειτα επαγωγή της έκφρασης των έως τότε ανενεργών γονιδίων- στόχων του παράγοντα αυτού. Παρόλο που η αλληλεπίδραση του ERF με την κινάση Erk2 πραγματοποιείται μέσω δύο μοτίβων FXF που εδράζονται στην ειδική επικράτεια αλληλεπίδρασης του ERF με την ERK (EID- ERK Interaction Domain), επιπλέον περιοχές μέσα στην επικράτεια αυτή φαίνεται να συμμετέχουν σε διαμοριακές επαφές προσδίδοντας ολική σταθερότητα στο σύμπλοκο που δημιουργείται. Συνεπώς, σκοπός της μελέτης αυτής ήταν ο καθαρισμός των δύο αυτών πρωτεϊνών και η μετέπειτα κρυστάλλωση του συμπλόκου που σχηματίζουν με στόχο την βαθύτερη κατανόηση όλων εκείνων των δομικών στοιχείων που καθορίζουν την εν λόγω αλληλεπίδραση.
Η σημασμένη με His-tag κινάση Erk2, ούσα στην ενεργό φωσφορυλιωμένη μορφή της λόγω συν-έκφρασης με ένα συστατικά ενεργό μετάλλαγμα της MEK1 κινάσης, απομονώθηκε σε πρώτη φάση μέσω χρωματογραφίας συγγένειας Ni+2 (IMAC- Immobilized Metal- Affinity Chromatography). Ο διαχωρισμός της διπλά φωσφορυλιωμένης, κι άρα πλήρως ενεργούς πρωτεΐνης, από τη μη- φωσφορυλιωμένη, και συνεπώς ανενεργή, επιτεύχθηκε μέσω χρωματογραφίας ανιοντοανταλλαγής στην κολώνα Mono Q HR5/5. Η σημασμένη με GST tag (glutathione S- transferase tag) επικράτεια EID του παράγοντα ERF απομονώθηκε στο πρώτο βήμα καθαρισμού με χρωματογραφία συγγένειας GST. Όμως, η εκτεταμένη πρωτεόλυση της GST-ERF (EID) πρωτεΐνης σε συνδυασμό με το γεγονός ότι η GST αυτή καθ’ αυτή είναι διμερής ως προς την τεταρτοταγή της δομή, οδήγησαν στην εμφάνιση ετεροδιμερών συμπλόκων μεταξύ της πρωτεΐνης πλήρους μήκους και των πρωτεολυτικών τμημάτων αυτής. Παρ’ όλα αυτά, πετύχαμε την απομόνωση ενός πληθυσμού αποτελούμενου αποκλειστικά από ομοδιμερή της πλήρους μήκους πρωτεΐνης μέσω χρωματογραφίας μοριακής διήθησης στην κολώνα Sephacryl S-200 HR16/60. Τέλος, σε μία προσπάθεια αποφυγής του διμερισμού, προχωρήσαμε στην επανακλωνοποίηση της EID του ERF σε φορέα ειδικό για την προσάρτηση του His-tag στην πρωτεΐνη στόχο. Η νέα πρωτεΐνη απομονώθηκε αρχικά με χρωματογραφία συγγένειας Ni+2 και στη συνέχεια καθαρίστηκε περαιτέρω με χρωματογραφία κατιοντοανταλλαγής στην κολώνα Mono S HR5/5. Αναμένουμε ότι το έργο αυτό όταν ολοκληρωθεί, θα αποσαφηνίσει τον τρόπο με τον οποίο συντελείται η αλληλεπίδραση αυτή κι επιπλέον δύναται να ανοίξει το δρόμο προς την ανακάλυψη ενός εκλεκτικού αναστολέα, με πιθανή εφαρμογή στις περιπτώσεις στις οποίες πρέπει να διασφαλισθούν υψηλότερα επίπεδα ERF πρωτεΐνης στον πυρήνα, όπως π.χ. στην περίπτωση της σχετιζόμενης με τον ERF κρανιοσυνόστωσης.
|
Structural study of the interaction between ETS2 Repressor Factor (ERF) and kinase Erk2
