| Περίληψη |
Η ανθεκτικότητα στα εντομοκτόνα αποτελεί ένα πολύ σημαντικό εμπόδιο για τον αποτελεσματικό έλεγχο εντόμων που είναι επιβλαβή στη γεωργία ή είναι φορείς ασθενειών. Ανθεκτικότητα σε όλες τις μεγάλες κατηγορίες εντομοκτόνων (οργανοφωσφορικά, καρβαμιδικά και πυρεθροειδή) έχει εμφανιστεί, σχετικά σύντομα μετά την εισαγωγή της χρήσης τους, σε πληθυσμούς πολλών ειδών εντόμων.
Τα νεονικοτινοειδή αποτελούν μία από τις πλέον υποσχόμενες κατηγορίες εντομοκτόνων, με την Ιμιδακλοπρίδη ως το πιο επιτυχημένο μέλος της ομάδος, με τις μεγαλύτερες πωλήσεις παγκοσμίως. Τα νεονικοτινοειδή δρουν ως αγωνιστές των μετασυναπτικών νικοτινικών υποδοχέων ακετυλοχολίνης στο κεντρικό νευρικό σύστημα του εντόμου. Παρά το ότι τα νεονικοτινοειδή παραμένουν εξαιρετικά αποτελεσματικά, μελέτες πεδίου δείχνουν σημαντική αύξηση εμφάνισης ανθεκτικότητας σε διάφορα είδη επιβλαβών εντόμων.
Η κατανόηση των μηχανισμών ανθεκτικότητας σε εντομοκτόνα είναι απαραίτητη για την περαιτέρω ανάπτυξη εργαλείων και παρεμβάσεων που μπορούν να βελτιώσουν τον έλεγχο των επιβλαβών εντόμων. Μέχρι τώρα έχουν χαρακτηριστεί δύο κύριοι μηχανισμοί οι οποίοι, μόνοι ή σε συνδυασμό, είναι υπεύθυνοι για την ανθεκτικότητα στα εντομοκτόνα: η ανθεκτικότητα στόχου και η μεταβολική ανθεκτικότητα. Η ανθεκτικότητα στόχου είναι αποτέλεσμα μεταλλαγών στο μόριο-στόχο του εντομοκτόνου. Μεταβολική ανθεκτικότητα προκαλείται συνήθως από την ενεργοποίηση ή την υπερέκφραση ενζύμων που εμπλέκονται στην αποτοξίνωση του εντομοκτόνου. Βιοχημικές μελέτες έχουν δείξει ότι η μεταβολική ανθεκτικότητα συνδέεται γενικά με τρεις οικογένειες ενζύμων: οξειδάσες μεικτής λειτουργίας (κυτοχρώματα Ρ450) καρβοξυλ-εστεράσες και S-τρανσφεράσες γλουταθειόνης (GST). Η μοριακή βάση της ανθεκτικότητας στόχου είναι αρκετά καλά μελετημένη και κατανοητή, αντίθετα οι βασικοί μοριακοί μηχανισμοί της μεταβολικής ανθεκτικότητας παραμένουν σε μεγάλο βαθμό άγνωστοι.
Ένα σημαντικό μέρος της γνώσης μας σχετικά με τους μηχανισμούς ανθεκτικότητας προέρχεται από τη μελέτη φυσικών πληθυσμών που έχουν αναπτύξει ανθεκτικότητα. Η επαγωγή ανθεκτικότητας σε εργαστηριακούς πληθυσμούς μέσω μεταλλαξιγένεσης αποτελεί μια εναλλακτική πειραματική προσέγγιση, η οποία έχει δώσει πρόσφατα σημαντικές πληροφορίες. Στην παρούσα μελέτη, χρησιμοποιήθηκε μεταλλαξιγένεση μέσω του μεταθετού στοιχείου Minos για τη δημιουργία ανθεκτικών στελεχών σε έναν εργαστηριακό πληθυσμό του εντόμου-μοντέλου Drosophila melanogaster.
Το μεταθετό στοιχείο (ΜΣ) Minos, μέλος της υπεροικογένειας Tc1/mariner, έχει χρησιμοποιηθεί για μεταλλαξιγένεση ή/και διαγένεση σε διάφορα είδη ευκαρυωτικών οργανισμών, και κυρίως στη Δροσόφιλα. Το γεγονός ότι τρανσποζόνια με βάση το Minos, μετά από κινητοποίηση μέσω της Minos τρανσποζάσης, παράγουν σταθερές ενθέσεις στα χρωματοσώματα με υψηλή απόδοση και με τελείως τυχαίο τρόπο έχει αναδείξει πρόσφατα την μεταλλαξιγένεση μέσω του στοιχείου αυτού ως ένα εξαιρετικά χρήσιμο εργαλείο γενετικής και γονιδιωματικής ανάλυσης.
Η Δροσόφιλα, αν και δεν είναι επιβλαβές είδος, έχει χρησιμοποιηθεί εκτενώς ως πειραματικό μοντέλο στην έρευνα για την κατανόηση των μηχανισμών ανθεκτικότητας σε εντομοκτόνα. Μελέτες σε φυσικούς και εργαστηριακούς πληθυσμούς της D. melanogaster έχουν καταδείξει ότι το είδος αυτό μπορεί να αναπτύξει ανθεκτικότητα σε ένα ευρύ φάσμα εντομοκτόνων. Κύριος στόχος της παρούσης μελέτης είναι η ταυτοποίηση γονιδίων της Δροσόφιλας που εμπλέκονται στην ανθεκτικότητα σε νεονικοτινοειδή εντομοκτόνα, με απώτερο στόχο την κατανόηση των σχετικών μοριακών μηχανισμών.
Η παρουσίαση των αποτελεσμάτων χωρίζεται σε δύο μέρη. Το πρώτο μέρος αφορά σειρά πειραμάτων τα οποία καταδεικνύουν την καταλληλότητα ενός αποδοτικού γενετικού συστήματος με βάση το ΜΣ για τη δημιουργία τυχαίων ενθέσεων οι οποίες ενεργοποιούν παρακείμενα γονίδια. Το σύστημα αυτό στηρίζεται στο τρανσποζόνιο Minos TREP, το οποίο περιέχει έναν χιμαιρικό υποκινητή που επάγεται in trans από τον μεταγραφικό ενεργοποιητή tTA. Στο δεύτερο μέρος παρουσιάζεται η τοξικολογική, βιοχημική, γονιδιωματική και γενετική ανάλυση ενός μεταλλαγμένου στελέχους ανθεκτικού στην Ιμιδακλοπρίδη και το DDT, το οποίο απομονώθηκε από μια σάρωση του γονιδιώματος της Δροσόφιλας με τη χρήση του TREP.
Για την ανάπτυξη συστήματος σάρωσης του γονιδιώματος χρησιμοποιήθηκε το διαγονιδιακό στέλεχος TREP 2.30, το οποίο περιέχει μια ένθεση του τρανσποζονίου TREP στο χρωματόσωμο 4. Η ένθεση αυτή σε ομόζυγη κατάσταση δεν έχει φαινότυπο, αλλά είναι θανατογόνος σε ετερόζυγη κατάσταση, σε συνδυασμό με ένα διαγονιδιακό χρωματόσωμο που εκφράζει τον μεταγραφικό ενεργοποιητή tTA. Δεδομένου ότι το τρανσποζόνιο TREP είναι γενετικά σεσημασμένο με το γονίδιο-δείκτη white, είναι εύκολο να επιλεγούν έντομα στα οποία έχει συντελεστεί μετακίνηση του TREP από την αρχική του θέση στο γονιδίωμα σε άλλη θέση. Η συχνότητα της μετακίνησης του τρανσποζονίου TREP στους γαμέτες του στελέχους TREP 2.30, μετά από επαγωγή μέσω έκφρασης της Minos τρανσποζάσης, αποδείχτηκε εξαιρετικά υψηλή (92%) με τα 2/3 των νέων ενθέσεων να εντοπίζονται στα 3 μείζονα χρωματοσώματα (Χ, 2ο και 3ο). Για τον εντοπισμό γονιδίων που ενέχονται στην ανθεκτικότητα, διενεργήθηκε μεγάλης κλίμακας σάρωση του γονιδιώματος κατά την οποία παρήχθησαν περίπου 12900 νέες ενθέσεις TREP, που αντιστοιχούν σε στόχευση του 35% των γονιδίων της Δροσόφιλας. Τα αποτελέσματα αυτά καταδεικνύουν ότι το σύστημα TREP 2.30 είναι ένα χρήσιμο εργαλείο για μεγάλης κλίμακας γενετικές σαρώσεις του γονιδιώματος της Δροσόφιλας. Κατά τη διάρκεια της σάρωσης έγινε επιλογή ενός θηλυκού εντόμου με μεγάλη ανθεκτικότητα στην Ιμιδακλοπρίδη, από το οποίο μετά τις κατάλληλες διασταυρώσεις ιδρύθηκε ένα ανθεκτικό στέλεχος, το MIT[w-]3R2. Γενετική ανάλυση του χρωματοσώματος MIT[w-]3R2 έδειξε ότι ο χαρακτήρας της ανθεκτικότητας εντοπίζεται στο χρωματόσωμα 2, αλλά δεν έδειξε σύνδεση με το τρανσποζόνιο TREP, υποδηλώνοντας ότι η μεταλλαγή οφείλεται πιθανώς σε φαινόμενο "hit and run", δηλαδή ένθεση του τρανσποζονίου μετά την οποία έγινε εκτομή. Το στέλεχος MIT[w-]3R2 αναλύθηκε περαιτέρω με τη χρήση τοξικολογικών, βιοχημικών, γονιδιωματικών και γενετικών προσεγγίσεων.
Η διασταυρούμενη ανθεκτικότητα του στελέχους MIT[w-]3R2 στο DDT, που έχει διαφορετικό στόχο αλλά παρόμοιο μηχανισμό αποτοξίνωσης με την Ιμιδακλοπρίδη, αποτέλεσε σοβαρή ένδειξη ότι η ανθεκτικότητα στο στέλεχος MIT[w-]3R2 έχει μεταβολική βάση. Τοξικολογική και βιοχημική ανάλυση, με τη χρήση του αναστολέα του P450 PBO και τον προσδιορισμό της ενζυμικής δραστικότητας P450 αντίστοιχα, απέδειξαν ότι η ανθεκτικότητα οφείλεται, εν μέρει τουλάχιστον, σε αυξημένη δραστηριότητα του P450 στο στέλεχος MIT[w-]3R2 σε σύγκριση με το ισογονιδιακό στέλεχος iso31 (w1118iso; 2iso; 3iso) που χρησιμοποιήθηκε ως στέλεχος αναφοράς. Δεν εντοπίστηκε αυξημένη δραστηριότητα της GST και εστερασών στο ανθεκτικό στέλεχος. Μοριακή ανάλυση έδειξε ότι το στέλεχος MIT[w-]3R2 χαρακτηρίζεται από υπερέκφραση των mRNA των τριών γονιδίων P450 (Cyp6g1, Cyp6a2 και Cyp12d1) που είναι ήδη γνωστό ότι ενέχονται σε ανθεκτικότητα σε νεονικοτινοειδή και το DDT.
Μεταγραφωματική ανάλυση του ανθεκτικού στελέχους και του ευαίσθητου στελέχους-μάρτυρα μέσω βαθειάς αλληλούχισης cDNA (cDNA deep sequencing) με την τεχνολογία Illumina διενεργήθηκε με στόχο την ποσοτικοποίηση των διαφορών στην έκφραση όλων των γονιδίων στα δύο στελέχη. Ταυτοποιήθηκαν 357 διαφορετικά γονίδια, από τα οποία 150 ήταν υπερ-εκφραζόμενα, και 207 υπο-εκφραζόμενα στο ανθεκτικό στέλεχος. Ταξινόμηση και ομαδοποίηση των διαφορικά εκφραζόμενων γονιδίων με βάση λειτουργικές ομοιότητες εντόπισαν τρεις λειτουργικές ομάδες υπερ-εκφραζομένων γονιδίων και δύο λειτουργικές ομάδες υπο-εκφραζομένων γονιδίων. Στην πρώτη κατηγορία υπερεκπροσωπούνται γονίδια που κωδικοποιούν οξειδάσες μεικτής λειτουργίας Ρ450, πρωτεολυτικά ένζυμα και πρωτεΐνες με δραστικότητα πεπτιδάσης. Στην κατηγορία των υπο-εκφραζόμενων γονιδίων υπερεκπροσωπούνται γονίδια που κωδικοποιούν πρωτεΐνες του χορίου των ωοκυττάρων και μια ομάδα γονιδίων για πρωτεϊνες με δραστικότητα πεπτιδάσης.
Τα πλέον έντονα υπερ-εκφραζόμενα γονίδια P450 που εντοπίστηκαν με αυτήν την προσέγγιση και επιβεβαιωθηκαν με real time PCR, είναι τα Cyp4p2, Cyp6a2 και Cyp6g1. Η συμμετοχή των Cyp6a2 και Cyp6g1 στο μηχανισμό ανθεκτικότητας σε εντομοκτόνα στη Δροσόφιλα έχει ήδη τεκμηριωθεί και τα αποτελέσματά μας επικυρώνουν τη χρησιμότητα της μεταγραφωματικής προσέγγισης για την ανίχνευση γονιδίων που εμπλέκονται στην ανθεκτικότητα στα εντομοκτόνα. Αυξημένη έκφραση του γονιδίου Cyp4p2 σε έντομο ανθεκτικό στην Ιμιδακλοπρίδη και το DDT αναφέρεται για πρώτη φορά.
Ο ρόλος των πρωτεολυτικών ενζύμων και των ενζύμων με δραστικότητα πεπτιδάσης στην ανθεκτικότητα δεν είναι πλήρως κατανοητός. Οι πρωτεάσες πιθανώς να συμμετέχουν στην τροποποίηση της διαμόρφωσης ενζύμων και στη βιοσύνθεση πρωτεϊνών, προκειμένου να καλυφθούν οι ενεργειακές ανάγκες κατά τη διάρκεια του ξενοβιοτικού στρες. Η ελαττωμένη έκφραση ενός αριθμού γονιδίων που κωδικοποιούν δομικές πρωτεϊνες του χορίου θα μπορούσε να προκύψει ως
αποτέλεσμα της γενικής απάντησης στο στρες που προκαλείται από το ενεργοποιημένο σύστημα αποτοξίνωσης.
Λειτουργική ομαδοποίηση των διαφορικά εκφραζόμενων γονιδίων με βάση την πρόβλεψη της βιολογικής τους λειτουργίας εντόπισε 10 υπερ-εκπροσωπούμενες ομάδες υπερ-εκφραζόμενων γονιδίων και 13 υπερ-εκπροσωπούμενες ομάδες υπο-εκφραζόμενων γονιδίων στο ανθεκτικό στέλεχος. Ανάμεσα στα υπερ-εκφραζόμενα γονίδια ξεχώρισαν οι λειτουργικές ομάδες "οξειδοαναγωγική δραστηριότητα", "μιτωτικός διαχωρισμός αδελφών χρωματίδων", "δραστηριότητα μεταφοράς ηλεκτρονίων" και "απάντηση σε βλάβες DNA". Στα υπο-εκφραζόμενα γονίδια περιλαμβάνονταν οι ομάδες "μεταβολισμός χιτίνης και αμινογλυκανών", "απάντηση σε μόλυνση με βακτήρια" και "δραστηριότητα ανοσολογικής απάντησης". Η οξειδοαναγωγική δραστηριότητα παίζει σημαντικό ρόλο στην αποτοξίνωση, ενώ οι άλλες βιολογικές διεργασίες θα μπορούσε να είναι μια ένδειξη γενικής αντίδρασης στο στρες από το ανθεκτικό έντομο.
Η απουσία σύνδεσης του τρανσποζονίου TREP με τον γενετικό τόπο της ανθεκτικότητας υποδηλώνει ότι η μεταλλαγή πιθανώς οφείλεται σε φαινόμενο "hit and run", δηλαδή αρχική ένθεση του τρανσποζονίου το οποίο ακόλουθα αποκόπηκε, προκαλώντας μια τοπική χρωματοσωμική ανωμαλία (τοπικό έλλειμα, μικρή ένθεση, ή συνδυασμό τους). Ως εκ τούτου, η χαρτογράφηση του γενετικού τόπου της ανθεκτικότητας έγινε με κλασσική γενετική ανάλυση (ανάλυση ανασυνδυασμού με χαρτογραφημένες ενθέσεις του ΜΣ P) και με ανάλυση πολυμορφισμών μοναδικών νουκλεοτιδίων (SNPs) οι οποίες προέκυψαν από την αλληλούχιση του μεταγραφώματος. Ο γενετικός τόπος εντοπίζεται στο δεξιό σκέλος του δεύτερου χρωμοσώματος, σε μια περιοχή μικρότερη από 1Mb. Μέσα στην ίδια περιοχή βρίσκεται και το γονίδιο Cyp6g1, το οποίο είναι ένα από τα πλέον ισχυρά υπερ-εκφραζόμενα γονίδια στο στέλεχος MIT[w-]3R2 και έχει ήδη περιγραφεί ως βασικός παράγοντας ανθεκτικότητας στη Ιμιδακλοπρίδη.
Ανάλυση της αλληλουχίας του mRNA του Cyp6g1 δεν έδωσε ένδειξη για ύπαρξη μεταλλαγής στην κωδική περιοχή του γονιδίου στο ανθεκτικό στέλεχος. Είναι πιθανόν να έχει συντελεστεί μια μεμονωμένη μεταλλαγή σε cis-ρυθμιστικό στοιχείο του γονιδίου Cyp6g1, η οποία οδηγεί σε αύξηση της έκφρασης του γονιδίου, που με τη σειρά της επηρεάζει την έκφραση άλλων γονιδίων που εμπλέκονται σε ανθεκτικότητα. Εναλλακτικά, η μεταλλαγή μπορεί να αφορά ένα γονίδιο που αντιστοιχεί σε έναν παράγοντα μεταγραφής ή ένα microRNA, που ρυθμίζει πολλαπλά γονίδια Ρ450. Μέχρι στιγμής, δεν υπάρχουν στοιχεία που να υποστηρίζουν την τελευταία υπόθεση, δεδομένου ότι μια in silico αναζήτηση απέτυχε να εντοπίσει κοινά μοτίβα προσδεσης, είτε για κάποιον από τους γνωστούς παράγοντες μεταγραφής, είτε για κάποιο microRNA, στα γονίδια P450 τα οποία υπερ-εκφράζονται. Μελλοντική ανάλυση της αλληλουχίας γονιδιωματικού DNA στην περιοχή όπου εντοπίζεται ο γενετικός τόπος, πιθανώς να αποκαλύψει τη μοριακή βάση της ανθεκτικότητας στο στέλεχος MIT[w-]3R2.
|
Identification and characterization of genes involved in resistance to neonicotinoid insecticides in Drosophila melanogaster
