| Περίληψη |
Η RNA σίγηση είναι ένας ευρύτατα διαδεδομένος μηχανισμός αρνητικής ρύθμισης της γονιδιακής έκφρασης. Εμπλέκεται σε διάφορα αναπτυξιακά φαινόμενα σε όλους τους ευκαρυώτες, την καρκινογένεση στα θηλαστικά, ενώ μία από τις βασικότερες λειτουργίες
του μηχανισμού στους φυτικούς οργανισμούς είναι αυτή της άμυνας ενάντια σε ιούς και μεταθετά στοιχεία. Μέχρι σήμερα έχουν ταυτοποιηθεί διάφορα μονοπάτια στα οποία εμπλέκεται ο μηχανισμός, με κύριο χαρακτηριστικό όλων την παραγωγή μικρών RNAs της
τάξης των 21-24 νουκλεοτιδίων που αποτελούν τους κύριους τελεστές του μηχανισμού. Υπέυθυνα ένζυμα για την παραγωγή αυτών των RNAs είναι οι πρωτεΐνες τύπου Dicer (Dicer-like proteins, DCLs). Ρόλος των μικρών RNAs, ο οποίος ορίζεται από το μέγεθος τους και την DCL από την οποία παρήχθησαν, είναι η στόχευση ομόλογων DNA και RNA
αλληλουχιών προς μεθυλίωση ή αποικοδόμηση αντίστοιχα.
Τα ιοειδή αποτελούν τα απλούστερα φυτικά παθογόνα με ικανότητα τοπικής και διασυστηματικής μόλυνσης. Το γονιδίωμα τους αποτελείται από ένα μονόκλωνο μόριο RNA, άνευ περιβλήματος που δεν κωδικοποιεί καμία πρωτεΐνη. Το ιοειδές, ή και τα ενδιάμεσα δίκλωνα μόρια του πολλαπλασιασμού του φαίνεται ότι αποτελεί υπόστρωμα
για τις DCLs. Τα μικρά RNAs που παράγονται είναι βιολογικά ενεργά in trans, αλλά κατά πάσα πιθανότητα όχι in cis, καθώς το ιοειδές διατηρεί την ικανότητα μόλυνσης, χωρίς να φαίνεται να επηρεάζεται ο τίτλος του.
Στην παρούσα διδακτορική διατριβή μελετήθηκε η επίδραση της RNA σίγησης στη μολυσματικότητα του ιοειδούς Potato Spindle tuber Viroid (PSTVd), όπως και η επίδραση που έχει το PSTVd σε χαρακτηρισμένα μονοπάτια της RNA σίγησης. Προηγούμενη μελέτη στο εργαστήριο είχε ως αποτέλεσμα την απομόνωση και κλωνοποίηση τμημάτων των
πρωτεϊνών DCL από τους μη αλληλουχημένους οργανισμούς Nicotiana benthamiana και Lycopersicon esculentum. Τα ένζυμα αυτά είναι λειτουργικά και δομικά συντηρημένα σε μεγάλο βαθμό στους ευκαρυώτες. Τα απομονωμένα τμήματα χρησιμοποιήθηκαν για την
παραγωγή κατασκευών, οι οποίες μέσω RNA σίγησης οδηγούν στην καταστολή των DCLs στους παραπάνω οργανισμούς.
Στην εργασία αυτή, προχωρήσαμε στην παραγωγή διαγονιδιακών φυτών N. benthamiana που είναι κατεσταλμένα για τις DCLs και τα φυτά αυτά χρησιμοποιήθηκαν ως εργαλεία στη μελέτη του βιολογικού κύκλου του PSTVd. Συγκεκριμένα, αναλύθηκε η επίδραση όλων των DCLs i) στην επεξεργασία του ιοειδούς ή/και των δίκλωνων μορφών
του ii) στη διασυστηματική ικανότητα μόλυνσης του ιοειδούς συναρτήσει χρόνου και iii) στον πολλαπλασιασμό του σε κυτταρικό επίπεδο. Τα αποτελέσματα μας δείχνουν πως οι DCL2, DCL3 και DCL4 πέπτουν το ιοειδές προς μικρά RNA μόρια, 22-, 24- και 21 ντ
αντιστοίχως. Το γεγονός ότι ανιχνεύσαμε μικρά RNA μόρια θετικής και αρνητικής πολικότητας υποδηλώνει ότι τα ενδιάμεσα μόρια του πολλαπλασιασμού του είναι υπόστρωμα για αυτές τις DCLs. Ο ρόλος της DCL1 ως προς την επεξεργασία του ιοειδούς δεν υπήρξε ξεκάθαρος.
Τα αποτελέσματά μας σε διασυστηματικό επίπεδο έδειξαν ενεργό ρόλο της DCL1 και DCL4, κάτι που δεν παρατηρήθηκε σε κυτταρικό επίπεδο. Το αξιοσημείωτο είναι πως το PSTVd μάλλον χρειάζεται, τουλάχιστον στα πρώτα στάδια διασυστηματικής μόλυνσης, την επεξεργασία του από τις DCLs αυτές. Οι αναλύσεις μας υποδεικνύουν ένα πιθανό
επικουρικό ρόλο της RNA σίγησης στη μόλυνση του PSTVd, κάτι που αντιβαίνει στον έως τώρα γνωστό ρόλο άμυνας της RNA σίγησης. Τέλος, δείξαμε πως το PSTVd μπορεί να καθυστερήσει την εμφάνιση μη εδραιωμένης ιικά επαγώμενης RNA σίγησης, αλλά δεν επηρεάζει την εκδήλωση ήδη εδραιωμένης ιικά επαγώμενης RNA σίγησης, υποδεικνύοντας έτσι ότι δε λειτουργεί ως καταστολέας της RNA σίγησης. Από τα παραπάνω καταλήγουμε πως τα ιοειδή, ενώ στοχεύονται από την RNA σίγηση, έχουν εξελιχθεί ώστε να
χρησιμοποιούν και στοιχεία του μηχανισμού αυτού προς όφελός τους.
|
Μελέτη του βιολογικού κύκλου του ιοειδούς Potato spindle tuber viroid σε φυτά Nicotiana benthamiana που είναι κατεσταλμένα για τις πρωτεΐνες τύπου Dicer
