| Περίληψη |
Το Chlorobaculum tepidum είναι ένα Gram-αρνητικό, πράσινο θειοβακτήριο το οποίο χαρακτηρίζεται απ’ την ικανότητά του να αναπτύσσεται μέσω αναερόβιας φωτοσύνθεσης, κατά την οποία οξειδώνονται ανόργανες ενώσεις θείου (θειούχα, θειοθειϊκά) για την παραγωγή ισχυρά ανηγμένων φερρεδοξινών χρησιμοποιώντας κέντρα αντίδρασης τύπου Ι (σιδήρου-θείου). Η καθήλωση του CO H2 γίνεται μέσω του αντίστροφου κύκλου του καρβοξυλικού οξέος. Στο θρεπτικό ανάπτυξης του Cba. tepidum, στο οποίο θειούχα και θειοθειϊκά συνυπάρχουν, οξειδώνονται κατά προτίμηση τα θειούχα με σχηματισμό εξωκυττάριων σφαιριδίων στοιχειακού θείου. Καθώς η ποσότητα θειούχων στο υδατικό διάλυμα ανάπτυξης εξαντλείται, το στοιχειακό θείο και τα θειοθειϊκά οξειδώνονται σε θειϊκά. Παρ’ όλα αυτά ο μοριακός μηχανισμός του φαινομένου αυτού δεν έχει κατανοηθεί πλήρως.
Για να αποκτήσουμε μια εικόνα για το μεταβολισμό του θείου καθώς και τη μεταφορά του μέσω της μεμβράνης, το Cba. tepidum αναπτύχθηκε κάτω από διαφορετικές συνθήκες. Τα κύτταρα του Cba. tepidum αναπτύχθηκαν κάτω από αναερόβιες συνθήκες στους 48 0C για 24-30 ώρες παρουσία 7,7mM θειούχων και 4mM θειοθειϊκών (πηγή Α), παρουσία μόνο 4mM θειοθειϊκών (πηγή Β) και παρουσία μόνο 7,7mM θειούχων (πηγή Γ). Αρχικά μελετήθηκε η επίδραση που έχουν τα θειοθειϊκά στο σχηματισμό ατομικού θείου, χρησιμοποιώντας φασματοφωτομετρία ορατού και ιοντική χρωματογραφία. Η μέτρηση των συγκεντρώσεων Bchl c, S0 και SO42- έδειξαν ότι η βέλτιστη ανάπτυξη του βακτηρίου πραγματοποιείται μεταξύ 26-28 ωρών και ευνοείται περισσότερο για την πηγή Α. Επιπλέον η προσθήκη αυξανόμενων συγκεντρώσεων θειούχων, που αποτελούν και τον κύριο δότη ηλεκτρονίων της φωτοσύνθεσης, βρέθηκε ανάλογη με τη συγκέντρωση της Bchl c, συνεπώς και με την αύξηση των κυττάρων του βακτηρίου.
Για την περαιτέρω κατανόηση του μηχανισμού του μεταβολισμού του θείου, αναλύθηκε το μεμβρανικό πρωτεόμα του βακτηρίου στις διαφορετικές συνθήκες ανάπτυξής του. Για την ανάλυση και τον χαρακτηρισμό του, το ολικό πρωτέομα χωρίστηκε σε δύο κλάσματα, το μεμβρανικό και το υδατοδιαλυτό. Η ανάλυση του μεμβρανικού πρωτεόματος πραγματοποιήθηκε με δισδιάστατη ηλεκτροφόρηση Tricine-SDS, συνδυάζοντας δύο πηκτές διαφορετικών συγκεντρώσεων. Από τα 59 πρωτεϊνικά στίγματα που αποκόπηκαν απ’ την πηκτή και υπέστησαν κατεργασία με θρυψίνη, τα 56 ταυτοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας φασματομετρία μάζας MALDI-TOF MS/MS. Οι πρωτεΐνες που ταυτοποιήθηκαν βρέθηκε να έχουν λειτουργικό ρόλο στη φωτοσύνθεση, τη μεταφορά ηλεκτρονίων και τη μετάφραση. Βάση της λειτουργίας τους, βρέθηκε ότι ένα ποσοστό 32% αυτών των πρωτεϊνών είναι ριβοσωμικές. Γι’ αυτό το λόγο έγινε δοκιμή της απομάκρυνσης των πρωτεϊνών αυτών απ’ τις μεμβράνες χρησιμοποιώντας EDTA. Το εμπλουτισμένο πλέον μεμβρανικό πρωτέομα συλλέχθηκε και αναλύθηκε με δισδιάστατη ηλεκτροφόρηση Tricine-SDS. Τα αποτελέσματα ταυτοποίησης των πρωτεϊνικών στιγμάτων έδειξαν την παρουσία ενός μεγαλύτερου αριθμού ριβοσωμικών πρωτεϊνών, και συγκεκριμένα ένα ποσοστό 52%, σε σχέση με αυτόν που βρέθηκε στο μη εμπλουτισμένο μεμβρανικό πρωτέομα. Γι’ αυτό το λόγο η μέθοδος εμπλουτισμού του μεμβρανικού πρωτεόματος απορρίφθηκε. Έτσι αναλύθηκαν και τα ολικά μεμβρανικά κλάσματα των πηγών Β και Γ με δισδιάστατη ηλεκτροφόρηση και τα πρωτεϊνικά στίγματα που προέκυψαν δεν υπερέβησαν σε αριθμό αυτά της πηκτής της πηγής Α. Οι ταυτοποιήσεις των στιγμάτων των πηκτών των πηγών Β και Γ, η εύρεση της θέσης τους μέσα στο κύτταρο καθώς και η προβλεπόμενη απ’ το γονιδίωμα λειτουργία τους, δεν έδειξαν σημαντικές διαφορές. Η μόνη διαφορά ίσως παρουσιάζεται στην ύπαρξη λιγότερων ριβοσωμικών πρωτεϊνών κατά την ανάπτυξη του βακτηρίου στην πηγή Α.
Το Cba. tepidum είναι ένα βακτήριο που διακρίνεται για την παρουσία μεγάλων συμπλεγμάτων-κεραίες τα οποία είναι προσκολλημένα στην κυτταροπλασματική του μεμβράνη μέσω της πρωτεΐνης FMO και έχουν την ικανότητα να δεσμεύουν το φως. Τα περισσότερα συστατικά του μηχανισμού έχουν γίνει γνωστά σε βιοφυσικό επίπεδο, ωστόσο η δομική διαμόρφωση αυτών των οργάνων συγκομιδής φωτός μέσα στο κύτταρο δεν έχει κατανοηθεί πλήρως. Έτσι στη συγκεκριμένη εργασία παρουσιάζεται για πρώτη φορά η τρισδιάστατη απεικόνιση της αρχιτεκτονικής του κυττάρου του Cba. tepidum, χρησιμοποιώντας cryo-electron microscopy. Με τη συγκεκριμένη μέθοδο επιτυγχάνεται η έρευνα ολόκληρων ενυδατωμένων κυττάρων, τα οποία έχουν αναπτυχθεί σε διαφορετικές πηγές θείου. Τα τομογραφήματα που προκύπτουν μας δίνουν τη δυνατότητα διάκρισης των χλωροσωμάτων, σε ελλειψοειδείς διαμορφώσεις με ομοιόμορφη ηλεκτρονική πυκνότητα, καθώς και των συνδετικών στοιχείων μεταξύ χλωροσωμάτων και κυτταροπλασματικής μεμβράνης.
|
Μελέτη του μεταβολισμού του θείου στο φωτοσυνθετικό θειοβακτήριο Chlorobaculum tepidum
