| Περίληψη |
Ο μετασχηματίζων αυξητικός παράγοντας β (TGFβ) είναι μια πλειοτροπική κυτταροκίνη η οποία ρυθμίζει πληθώρα βιολογικών διεργασιών όπως ο κυτταρικός πολλαπλασιασμός, η απόπτωση, η διαφοροποίηση, κ.α. O TGFβ σηματοδοτεί μέσω των υποδοχέων του που έχουν δράση κινάσης σερίνης/θρεονίνης και μέσω μιας μικρής ομάδας κυτταροπλασματικών πρωτεϊνών που ονομάζονται Smads οι οποίες φωσφορυλιώνονται από τους υποδοχείς και δρούν ως μεταγραφικοί ενεργοποιητές. Η απόκριση των κυττάρων στον TGFβ εξαρτάται από την αλληλεπίδραση των διαμεσολαβητών του με παράγοντες άλλων μονοπατιών (signaling cross talk) και η αλληλεπίδραση αυτή μπορεί να έχει θετική ή αρνητική επίδραση στο TGFβ μονοπάτι και την μεταγραφική δραστικότητα των Smad πρωτεϊνών. Ο σκοπός της παρούσας διατριβής ήταν: α) η μελέτη μηχανισμών θετικής και αρνητικής αλληλεπίδρασης του σηματοδοτικού μονοπατιού του TGFβ με άλλα σηματοδοτικά μονοπάτια και β) ο χαρακτηρισμός λειτουργικών περιοχών στην Smad3 που απαιτούνται για την μεταγραφική ενεργοποίηση γονιδίων. Στην 1η ενότητα μελετήσαμε τον μηχανισμό καταστολής της TGFβ σηματοδότησης από την λανθάνουσα μεμβρανική πρωτεΐνη 1 (Latent Membrane Protein 1, LMP1) του ιού Epstein-Barr που είναι υπεύθυνη για την ογκογόνο δράση του ιού σε διάφορους τύπους κυττάρων. Οι μελέτες μας έδειξαν ότι η LMP1 πρωτεΐνη καταστέλλει την TGFβ σηματοδότηση χρησιμοποιώντας το μονοπάτι που οδηγεί στην ενεργοποίηση του μεταγραφικού παράγοντα NF-kB. Προτείνουμε δυο εναλλακτικούς μηχανισμούς για την καταστολή από τον NF-kB: Συναγωνισμός για συνενεργοποιητές όπως ο p300 και άμεση πρόσδεση του NF-kB στην Smad3 με αποτέλεσμα την καταστολή της δράσης της τελευταίας στον πυρήνα. Φυσικές αλληλεπιδράσεις ανάμεσα στην Smad3 και τον NF-kB γίνονται μέσω της περιοχής 122-290 της Smad3 πρωτεΐνης και της RHD (Rel Homology Domain) περιοχής των υπομονάδων p65 και p50 του NF-κB. Στην 2η Ενότητα μελετήσαμε τις λειτουργικές αλληλεπιδράσεις μεταξύ της Smad3 και του ορφανού πυρηνικού υποδοχέα HNF4, οι οποίες οδηγούν σε TGFβ-επαγώμενη μεταγραφική ενεργοποίηση γονιδίων που εκφράζονται κατά κύριο λόγο στο ήπαρ όπως τα γονίδια των απολιποπρωτεϊνών. Η ενίσχυση της μεταγραφικής δραστικότητας του HNF4 από τις Smads επιτελείται μέσω της περιοχής AF1 του πρώτου (αμονοξέα 1-25) ενώ μεταλλάξεις σε υδρόφοβα αμινοξέα αυτής της περιοχής κατέστειλαν την ενεργοποιητική δράση των Smads. Βρέθηκε ότι οι πυρηνικοί υποδοχείς χρησιμοποιούν και πιθανά μοιράζονται κοινούς συνενεργοποητές με τον HNF4 όπως τα μέλη της οικογένειας των p160 συνενεργοποιητών (TIF2, SRC-1, Rac3) και o PGC1. Τέλος, στην 3η Ενότητα εκπονήσαμε μια ενδελεχή λειτουργική χαρτογράφηση των μεταγραφικά ενεργών περιοχών της πρωτεϊνης Smad3 και βρήκαμε ότι, εκτός της ΜΗ2 περιοχής, μια δεύτερη περιοχή που εντοπίζεται μεταξύ των αμινοξέων 200-248 και περικλείει τμήμα του linker και τα 18 πρώτα αμινοξέα της ΜΗ2 περιοχής, είναι απαραίτητη για την μεταγραφική δράση των Smads και την αλληλεπίδραση με άλλες πρωτεΐνες. Χρησιμοποιώντας μια νέα μέθοδο πρωτεϊνικών αλληλεπιδράσεων που βασίζεται στην βιοτινυλίωση in vivo, δείξαμε ότι η εσωτερική απαλοιφή της περιοχής 230-248 καθώς μια σημειακή μετάλλαξη στην θέση 238 (Ε238Α) η οποία στην περίπτωση της Smad4 σχετίζεται με καρκίνο, κατέστειλαν πλήρως την μεταγραφική ενεργότητα της πρωτεΐνης και την ικανότητα της να σχηματίζει ομοπολυμερή και ετεροπολυμερή με την Smad4. Αντίθετα, η εσωτερική απαλοιφή της περιοχής 200-230 του linker δεν επηρέασε την ικανότητα πολυμερισμού της πρωτεΐνης αλλά κατέστειλε την αλληλεπίδρασή της με τον συνενεργοποιητή p/CAF. Τα αποτελέσματα της παρούσας διατριβής καταδεικνύουν την σημασία της αντιπολλαπλασιαστικής δράσης (growth arrest) του TGFβ (μέσω ενεργοποίησης αναστολέων του κυτταρικού κύκλου) καθώς αποτελεί στόχο της ιικής πρωτεΐνης LMP1 σε επιθηλιακά κύτταρα. Επίσης, υποδηλώνεται ο ρόλος της TGFβ σηματοδότησης στην έκφραση ηπατοειδικών γονιδίων και συνεπώς σε διεργασίες όπως ο ενεργειακός μεταβολισμός, η ομοιόσταση λιπιδίων, η μείωση της χοληστερόλης, μέσω συνεργασιακής αλληλεπίδρασης των Smads με τον HNF-4. Η συνομιλία του TGFβ μονοπατιού με πυρηνικούς υποδοχείς ορμονών (μέσω λειτουργικής αλληλεπίδρασης με τους συνενεργοποιητές τους), εμπλέκει τον TGFβ σε διεργασίες όπως η λειτουργία του αναπαραγωγικού συστήματος, ή η ομοιόσταση γλυκογόνου. Ο λεπτομερής χαρακτηρισμός των περιοχών που ευθύνονται για την συνεργασιακή αλληλεπίδραση μεταξύ Smads και HNF-4, αποτελεί χρήσιμο εργαλείο σε περιπτώσεις απορύθμισης είτε της TGFβ σηματοδότησης (ίνωση και καρκίνος του ήπατος, λόγω υπερλειτουργίας του TGFβ), είτε της HNF-4 λειτουργίας (σύνδρομο MODY I, λόγω σημειακής μετάλλαξης του HNF-4). Η χαρτογράφηση των περιοχών της Smad3 πρωτεΐνης που ευθύνονται για την μεταγραφική της δραστικότητα και την αλληλεπίδρασή της με άλλες πρωτεΐνες θα αποτελέσει χρήσιμη γνώση για την κατασκευή μορίων που θα επάγουν την TGFβ σηματοδότηση, (σε περιπτώσεις μεταλλάξεων των Smad πρωτεϊνών όπως ο καρκίνος του γαστρεντερολογικού συστήματος και του πνεύμονα), ή θα την καταστέλλουν (σε περιπτώσεις υπερλειτουργίας του, όπως η ίνωση και οι μεταστάσεις). H κατανόηση των μηχανισμών με τους οποίους ρυθμίζεται ή απορυθμίζεται το σηματοδοτικό μονοπάτι του TGFβ έχει μεγάλη βιοϊατρική σημασία και εφαρμογές στην γονιδιακή θεραπεία νοσημάτων όπως ο καρκίνος, η ίνωση, η αθηροσκλήρωση κ.α.
|
Σχέση δομής-λειτουργίας και μηχανισμοί μεταγραφικής ενεργοποίησης των πρωτεινών Smad του ανθρώπου
