| Περίληψη |
Ασθένειες μεταδιδόμενες από φορείς απειλούν την δημόσια υγεία λόγω των ετήσιων θανάτων που προκαλούν και των περιβαλλοντικών αλλά και κοινωνικο-οικονομικών επιπτώσεων τους. Ειδικότερα, η λοιμώδης ασθένεια της ελονοσίας μεταδίδεται μέσω του τσιμπήματος από μολυσμένα θηλυκά κουνούπια. Τα κουνούπια Anopheles gambiae συγκαταλέγονται μεταξύ των πιο σημαντικών φορέων του παράσιτου της ελονοσίας P.falciparum (το πιο επικίνδυνο παθογόνο της ελονοσίας) και χαρακτηρίζεται ως τον μεγαλύτερο δολοφόνο παγκοσμίως.
Πιο συγκεκριμένα, στόχος της παρούσας εργασίας ήταν ο χαρακτηρισμός των CYP4G16/CYP4G17 του An. gambiae και η μελέτη του πιθανού ρόλου της μεμβρανικής πρωτεΐνης που προσδένει στεροειδή (MSBP,CG9066 ) ως πιθανός παράγοντας που προσδένεται και ρυθμίζει τα λειτουργία της CYP4G1 τα Δροσόφιλας. Τα γονίδια CYP4g εντοπίζονται αποκλειστικά στα έντομα και ορθόλογα τους εντοπίζονται διάσπαρτα σε όλα τα ‘Έντομα’, ενώ θεωρούνται γονίδια που συνέβαλλαν στην επιτυχή μετάβαση των εντόμων στο χερσαίο περιβάλλον (Feyereisen 2006). Το κουνούπι Anopheles gambiae έχει δύο γονίδια CYP4g, το CYP4g16 (τρία μετάγραφα –RA,-RB,-RC, που κωδικοποιούν την –PA ισομορφή και το –RD μετάγραφο, που αντιστοιχεί στην –PD ισομορφή) και το CYP4g17 (ένα μετάγραφο που αντιστοιχεί σε μια ισομορφή). Σχετικά, με την CYP4G1 της Δροσόφιλας έχει χαρακτηριστεί ως οξειδωτική αποκαρβονυλάση, καθώς καταλύει το τελικό βήμα στο βιοσυνθετικό μονοπάτι των υδρογονανθράκων της επιδερμίδας (Qiu et al. 2012). Οι υδρογονάνθρακες της επιδερμίδας δρουν ως ο πρώτος φραγμός προστασίας των εντόμων, όπως για παράδειγμα ενάντια σε εντομοκτόνα. Από τα παραπάνω προκύπτει ότι, τα γονίδια CYP4g πιθανόν να παίζουν ρόλο στο μονοπάτι βιοσύνθεσης των υδρογονανθράκων της επιδερμίδας. Αυτή η προτεινόμενη λειτουργία ίσως συμμετέχει στον μηχανισμό ανθεκτικότητας μέσω μειωμένης διαπερατότητας, που μπορεί να επιτευχθεί μέσω της ενίσχυσης της επιδερμίδας. Σύμφωνα με τα παραπάνω, γίνεται εμφανές ότι ο χαρακτηρισμός και η λειτουργική μελέτη των CYP4g γονιδίων είναι κρίσιμη.
Στην παρούσα εργασία, πραγματοποιήθηκε ανάλυση μεταγράφων, ιστο-ειδική και πρωτεομική σε συνδυασμό με μεθόδους ανοσοιστοχημείας για τον χαρακτηρισμό των CYP4Gs του An.gambiae. Αξιοποιήθηκε ακόμη, η τεχνική της λειτουργικής ανάλυσης in vivo RNAi για τον λειτουργικό χαρακτηρισμό του πιθανού ρόλου της μεμβρανικής πρωτεΐνης που προσδένει στεροειδή (MSBP) ως προτεινόμενος παράγοντας που προσδένεται και ρυθμίζει την λειτουργία της CYP4G1 της Δροσόφιλας.
Αρχικά, κάναμε προσπάθεια για την ανάλυση των μεταγράφων της CYP4g16 με αλληλούχιση κλώνων cDNA που υποδεικνύουν την παρουσία των –RA και –RB. Επίσης, ιστοειδική ανάλυση με τη χρήση της RT-PCR έδειξε ότι τα μετάγραφα CYP4g16 -RABC και -RD εντοπίζονται κυρίως στo κοιλιακό τοίχωμα καθώς και ότι τα –RABC εκφράζονται 100 φορές περισσότερο από το –RD. Εστιάσαμε σε συγκεκριμένους ιστούς, κεφάλι και κοιλιακό τοίχωμα, οι οποίοι έχουν σχετιστεί με την έκφρασή αυτών των γονιδίων (Balabanidou et al. 2013) (Ingham et al. 2014). Ανάλυση με MS στην CYP4G16 του An.gambiae σε διαχωρισμένους ιστούς κεφάλι και κοιλιακό τοίχωμα από θηλυκά κουνούπια υπόδειξαν την παρουσία της CYP4G16-PA ισομορφής και στους δύο ιστούς. Τα πειράματα ανοσοεντοπισμού σε προνύμφη 4ου σταδίου του An.gambiae δείχνουν την παρουσία και των δύο CYP4Gs μαζί με την οξειδωτική αναγωγάση στα οινοκύτταρα της προνύμφης καθώς και τα νεοσχηματισθέντα οινοκύτταρα των ενηλίκων. Επιπλέον, ανάλυση ανοσοεντοπισμού (συμπληρωματική προηγούμενης δουλειάς από την Μπαλαμπανίδου) στο κοιλιακό τοίχωμα του ενηλίκου έδειξε ότι οι CYP4Gs συνεντοπίζονται στα οινοκύτταρα μαζί με την οξειδωτική αναγωγάση. Η προτεινόμενη τοπολογία των δύο ισομορφών της CYP4G16 και της CYP4G17 του Anopheles gambiae στα οινοκύτταρα υποστηρίζει τον πιθανό ρόλο αυτών των πρωτεϊνών στην σύνθεση των υδρογονανθράκων της επιδερμίδας.
Στη συνέχεια, στον οργανισμό μοντέλο Δροσόφιλα, έγινε προσπάθεια μελέτης της ρύθμισης της λειτουργίας της CYP4G1. Ειδικότερα, στηριζόμενοι σε δεδομένα ιστο-ειδικής έκφρασης (www.flyatlas.org) και πειραματικές μελέτες (Qiu et al. 2012)(Fujii-taira et al. 2009) (Hughes et al. 2007) προσπαθήσαμε να διερευνήσουμε εάν ο μεμβρανική πρωτεΐνη που προσδένει στεροειδή (MSBP, CG9066) ρυθμίζει την λειτουργία της CYP4G1. Τελικά, τα φαινοτυπικά αποτελέσματα από την σίγηση των CYP4G1, CPR, MSBP (CG9066) υποδεικνύουν ότι ο MSBP (CG9066) δεν είναι ζωτικής σημασίας για την ρύθμιση της λειτουργίας της CYP4G1.
Η συγκεκριμένη μελέτη παρέχει σημαντικές πληροφορίες για τον χαρακτηρισμό ( και την πιθανή ρύθμιση) της CYP4Gs υπο-οικογένειας των P450s και μπορεί να συμβάλει στον σχεδιασμό νέων στόχων για τον έλεγχο των εντόμων.
|
Characterization of the CYP4G sub-family of P450’s from Anopheles gambiae and Drosophila melanogaster
