| Περίληψη |
Εισαγωγή
Σε παγκόσμια κλίμακα, ο καρκίνος του πνεύμονα είναι ο πιο κοινός τύπος καρκίνου όσον
αφορά στην επίπτωση αλλά και τη θνητότητα, αποτελώντας το 16% των κακοηθών όγκων
παγκοσμίως και ευθύνεται για το 28% των θανάτων από καρκίνο. Οι κύριοι παράγοντες κινδύνου
είναι το κάπνισμα, η περιβαλλοντική ρύπανση, η ακτινοβολία και η έκθεση σε άσβεστο, αν και
έχουν ενοχοποιηθεί και άλλοι περιβαλλοντικοί παράγοντες. Μεταξύ των παραγόντων αυτών,
ορισμένοι ιοί έχουν συσχετισθεί στενά με πολλούς τύπους ανθρώπινου καρκίνου, αφού είναι
παρόντες σε πολύ αρχικά στάδια στη διαδικασία της καρκινικής ανάπτυξης. Η συσσώρευση
γονιδιακών μεταλλάξεων διευκολύνει την ανάπτυξη καρκίνου και κακοήθους φαινοτύπου. Αυτές οι
μεταλλάξεις είναι καίρια συνδεμένες με την απόκτηση κυτταρικών ιδιοτήτων που σχετίζονται με
την αντίσταση στην απόπτωση, τον αρρύθμιστο πολλαπλασιασμό, τη διεισδυτική ικανότητα, τη
μετάσταση και την αγγειογένεση. Επιπλέον, η φλεγμονώδης απάντηση αξιώνει ένα ρόλο κλειδί
στην καρκινογένεση του πνεύμονα.
Οι πολυόμα ιοί είναι ιοί με διπλή έλικα DNA (double strand DNA-ds DNA) που περιέχεται
σε εικοσαεδρικής συμμετρίας καψίδιο. Οι ιοί JC (JCV), BK (BKV), Karolinska Institute (KIV),
Washington University (WUV) και ο ιός Merkel cell (MCPyV) έχουν βρεθεί σε ανθρώπους. Έχουν
μεγάλο επιπολασμό παγκόσμια και οι μολύνσεις ξεκινούν νωρίς στην παιδική ηλικία. Οι ΒΚV και
JVC έχουν ανευρεθεί μαζί με πολυμορφισμούς του γονιδίου p53 σε καρκίνο του πνεύμονα. Οι JVC
και BKV εγκαθιστούν επίμονες λοιμώξεις στο νεφρικό οστό και προκαλούν λευκοεγκεφαλοπάθεια.
Η σχέση των JVC και BKV με τον καρκίνο δεν έχει πλήρως διερευνηθεί ακόμα, αν και in vitro
πειράματα και μοντέλα ζώων έχουν ξεκάθαρα καθορίσει τη δυνατότητα των ιών αυτών για
ογκογενετική μεταλλαγή και στον καρκίνο του πνεύμονα. Οι KIV και WUV δεν έχουν σχετισθεί
ακόμα με κάποια παθολογία και, αν και ανευρίσκονται στο αναπνευστικό σύστημα συμπτωματικών
παιδιών, δεν τους έχει αποδοθεί κάποιος αιτιολογικός ρόλος σε αναπνευστικές λοιμώξεις. Από τους
πολυόμα ιούς ο MCPyV έχει κατηγορηθεί με πληθώρα μελετών για αιτιοπαθογενετικό ρόλο στον
ανθρώπινο καρκίνο. Ο MCPyV ανευρέθηκε αρχικά στο καρκίνωμα από κύτταρα Μέρκελ του
δέρματος, έναν πολύ επιθετικό καρκίνο από νευροενδοκρινικά κύτταρα. Στο μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα (SCLC) έχει συσχετισθεί με υπερμεθυλίωση του ογκοκατασταλτικού
γονιδίου RASSF1A, ενώ στον μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα (ΜΜΚΠ) ο MCPyV έχει
σχετισθεί μαζί με τον Human Papilloma Virus (HPV) σε ποσοστό 33% των ασθενών. Δεδομένα
αποδεικνύουν τη μεγάλη συγκέντρωση του MCPyV στο σάλιο και όλων των πολυόμα ιών στον
αμυγδαλικό ιστό, υποδεικνύοντας ίσως τον τρόπο εισόδου των ιών στο αναπνευστικό σύστημα.
Η συσσώρευση γενετικών και επιγενετικών γεγονότων στο αναπνευστικό επιθήλιο είναι
καίριας σημασίας για την καρκινογένεση του πνεύμονα. Συγκεκριμένα, τα microRNAs (miRNAs)
έχουν δειχθεί να είναι σημαντικά απορυθμισμένα. Τα microRNAs είναι μικρά, μη κωδικά μόρια
RNA και αποτελούν ρυθμιστές κλειδιά της γονιδιακής έκφρασης. Έχει προταθεί ότι εμπλέκονται
στην καρκινογένεση μέσω της ρύθμισης ογκογονιδίων και ογκοκατασταλτικών γονιδίων ή μέσω
άμεσης δράσης ως ογκογονίδια ή ογκοκατασταλτικά γονίδια. Ορισμένα miRNAs (epi-miR-NAs)
αλληλεπιδρούν με τη μεθυλίωση CpG νησιδίων και ρυθμίζουν τους παράγοντες του επιγενετικού
μηχανισμού, δημιουργώντας ένα αυστηρά ελεγχόμενο μηχανισμό ανάδρασης. Αρκετά
παραδείγματα απορυθμισμένων miRNAs έχουν αναγνωριστεί στο ΜΜΚΠ, όχι μόνο
επιδεικνύοντας το βιολογικό τους ρόλο, αλλά επίσης προτείνοντάς τα ως δυνητικούς μη-
επεμβατικούς διαγνωστικούς και θεραπευτικούς βιοδείκτες για τη συγκεκριμένη κακοήθεια.
Μια ιική αιτιολογία του καρκίνου του πνεύμονα είναι δελεαστική, αφού ένας ιός μπορεί να
θεωρηθεί ως το κύριο ογκογενετικό γεγονός ή ως ένας σημαντικός συμπαράγοντας, όπως στην
περίπτωση των μεσοθηλιωμάτων (Simian Virus 40 συν ασβέστωση). Υπό αυτό το σκεπτικό και
συνυπολογίζοντας το γεγονός ότι οι πολυόμα ιοί έχουν ήδη σχετισθεί με καρκίνο του πνεύμονα, η
παρούσα μελέτη στόχευσε στην διερεύνηση ιικής παρουσίας στον ανθρώπινο μη μικροκυτταρικό
καρκίνο του πνεύμονα καθώς και τις επιγενετικές αλλαγές που σχετίζονται με αυτήν.
Μέθοδοι- Ασθενείς
Διαδοχικοί ασθενείς από την Πνευμονολογική Κλινική του Περιφερειακού
Πανεπιστημιακού Γενικού Νοσοκομείου Ηρακλείου (Πε.Πα.Γ.Ν.Η) με πρόσφατη διάγνωση
καρκίνου του πνεύμονα εγγράφηκαν στη μελέτη: 110 διαδοχικοί ασθενείς με ΜΜΚΠ από την
Πνευμονολογική Κλινική του Πανεπιστημιακού Νοσοκομείου Ηρακλείου. Οι ασθενείς
κατηγοριοποιήθηκαν μεβάση τα κριτήρια του Παγκόσμιου Οργανισμού Υγείας (1997). Η ομάδα
των μαρτύρων περιλάμβανε 14 δείγματα από μακροσκοπικά υγιείς περιοχές πνεύμονα από τους
ασθενείς ΜΜΚΠ που υποβλήθησαν σε λοβεκτομή και επιβεβαιώθηκαν ιστολογικά. Κάθε ασθενής
έδωσε γραπτή δήλωση συγκατάθεσης για τη συμμετοχή στη μελέτη. Η διδακτορική διατριβή
χρηματοδοτήθηκε από ερευνητικά προγράμματα του Εργαστηρίου Κλινικής Ιολογίας και της
Πνευμονολογικής Κλινικής. Όλα τα δείγματα λήφθηκαν από τομές παραφίνης, προερχόμενες από χειρουργικά
παρασκευάσματα, από το εργαστήριο Παθολογοανατομίας του Πανεπιστημιακού Νοσοκομείου
Ηρακλείου. Η εξαγωγή νουκλεϊκών μακρομορίων έγινε με εμπορικά κιτ (DNA εξαγωγή με
QIAamp DNA FFPE Tissue Kit - Qiagen, Germany και RNA εξαγωγή με RecoverAllTM Total
nucleic acid isolation –Ambion) σύμφωνα με τις οδηγίες των κατασκευαστών. Η παρουσία
γενομικού υλικού πολυόμα ιών ανιχνεύθηκε με real-Time quantitave PCR. Τα επίπεδα των
μεταγράφων των miRNAs miR-21, miR-367, miR-155, miR-146a, miR-302c, miR-145 και miR-
376c καθώς και των γονιδίων K-ras, Braf, Rkip, Bax, Bcl-2, p53, RB1, Pten, Bcl-2, Daxx, Pkr,
Timp3, Grb2, Alk7, Mmp9, Oct4, Sox2, Fascin1, p53, Akt-1, Akt-2, Hif1a ανιχνεύθηκαν με real-
Time quantitave PCR. Ως γονίδιο αναφοράς για τα microRNAs χρησιμοποιήθηκε το miR191 και
για τα ελεγχόμενα γονίδια η Gapdh. Η εξαγωγή πρωτεϊνών έγινε με RIPA lysis buffer και για την
ανάλυση phosphor-BRAF (Ser445), BRAF και Bcl-2 (beta-actin ως πρωτεΐνη αναφοράς)
χρησιμοποιήθηκε Western ανοσοστύπωση. Για τη στατιστική ανάλυση χρησιμοποιήθηκε το
πρόγραμμα SPSS 11.5 software (SPSS, Chicago, IL, USA).
Αποτελέσματα
Ο πληθυσμός της μελέτης περιείχε 101 άνδρες και 9 γυναίκες ασθενείς με ΜΜΚΠ, με μέση
ηλικία 62.92±1.12. Η πλειοψηφία των ασθενών ήταν ενεργοί καπνιστές (87.3%). Ο ιστολογικός
τύπος ήταν κατά πλειοψηφία το αδενοκαρκίνωμα και ακολουθούσε το πλακώδες.
Όλα τα δείγματα ασθενών αλλά και τα δείγματα μαρτύρων ελέγθηκαν αρνητικά για την
ύπαρξη γενομικού υλικού BKV και JCV. MCPyV DNA ανιχνεύθηκε στο 9,1% των δειγμάτων με
ΜΜΚΠ, ενώ δεν ανιχνεύθηκε σε κανένα δείγμα μάρτυρα.. Η αναλογία Bax/Bcl2 ήταν 0.97 για το
ΜΜΚΠ ενώ 8.06 για τους μάρτυρες. Στα MCPyV θετικά δείγματα ΜΜΚΠ παρατηρήθηκε
υποέκφραση Bcl-2 καθώς και υπερέκφραση του Braf συγκριτικά με τα MCPyV αρνητικά δείγματα
ΜΜΚΠ. Τα αποτελέσματα για τα γονίδια αυτά επιβεβαιώθηκαν και στο επίπεδο της πρωτεΐνης.
Καμία στατιστικά σημαντική συσχέτιση δεν παρατηρήθηκε ανάμεσα στα επίπεδα έκφρασης και σε
κλινικές παραμέτρους.
Η ανάλυση των miRNAs ανέδειξε σημαντική υπερέκφραση των miR-21 και miR-376c,
αλλά σημαντική υποέκφραση του miR-145 στα MCPyV θετικά δείγματα ΜΜΚΠ συγκριτικά με τα
MCPyV αρνητικά. Συνολικά, η έκφραση των miR-21 και miR-376c ήταν μεγαλύτερη σε δείγματα
ΜΜΚΠ συγκριτικά με τα δείγματα μάρτυρα. Τα επίπεδα λεκφρασης των miRNAs miR-155, miR-
146a, miR-302c και miR-367 δε συσχετίσθηκαν με την παρουσία του MCPyV. Η έκφραση των
γονιδίων στόχων των miR-21 (Pten, Bcl-2, Daxx, Pkr, Timp3), miR-376c (Grb2, Alk7, Mmp9) και
miR-145 (Oct-4, Sox2, Fascin1) καθώς και των γονιδίων συναφών μονοπατιών (Braf, Akt-1, Akt-2, Bax, Hif1a, p53) ήταν απορυθμισμένη μεταξύ των MCPyV θετικών δειγμάτων ΜΜΚΠ και των
αντιστοίχων μαρτύρων.
Συζήτηση
Στην παρούσα μελέτη, η ανάδειξη της παρουσίας τους πολυόμα ιού MCPyV στο 9,1% των
περιπτώσεων ΜΜΚΠ έρχεται να συμπληρώσει παλαιότερες μελέτες eπίπτωσης του MCPyV στο
ΜΜΚΠ, μιας συμμελέτης MCPyV και Human Papilloma Virus (HPV) στο 16,7% και μιας μελέτης
από τη Χιλή στο 4,7%. Η γεωγραφική κατανομή και οι διαφορές στις αναλογίες των ιστολογικών
τύπων μεταξύ των μελετών είναι αξιοσημείωτες, όμως είναι σημαντικό να αποδοθεί σημασία στο
γεγονός ότι ο MCPyV είναι παρόν σε αρκετές περιπτώσεις ΜΜΚΠ ανά τον κόσμο, ώστε να αξίζει
να διερευνηθεί η συσχέτισή του με την ογκογένεση του ΜΜΚΠ.
Η παρουσία και μόνο ενός ιού δεν αποτελεί αρκετό και αναγκαίο γεγονός για την
ογκογένεση, όμως η μακρόχρονη παρουσία ενός ιού και των πρωτεινών του σε ένα κύτταρο
μπορούν να συνεισφέρουν σε ένα περιβάλλον ευεργετικό για τον ιό, παίζοντας σημαντικό ρόλο στη
μετάβαση από πρόδρομη νεοπλασία σε κακοήθεια. Για το λόγο αυτό διερευνήσαμε γονίδια που
σχετίζονται με βασικές κυτταρικές λειτουργίες. Το κύριο αποτέλεσμα ήταν η υπερέκφραση του
γονιδίου Braf σε MCPyV θετικά δείγματα ΜΜΚΠ. Οι μεταλλάξεις του Braf θεωρούνται
εξαιρετικοί θεραπευτικοί στόχοι, ενώ δυο βασικά σηματοδοτικά μονοπάτια που ενεργοποιούνται
από το middle T antigen (MT) των πολυόμα ιών είναι τα mitogen-activated protein kinase (MAPK)
μέσω του Ras/raf pathway και ο καταρράκτης phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K). Η
υπερέκφραση του Braf που οδηγεί σε κατάδρομη υπερέκφραση του μονοπατιού MAPK/ERK
pathway και, εν τέλει, σε απρόσφορο κυτταρικό πολλαπλασιασμό, ίσως να είναι άμεσο αποτέλεσμα
του μετασχηματισμού του κυττάρου από τις πολυόμα πρωτεΐνες, συνεισφέροντας έτσι στην
καρκινογένεση. Η υποέκφραση του γονιδίου Bcl-2, όπως στα MCPyV θετικά δείγματα ΜΜΚΠ της
παρούσας μελέτης, έχει συσχετισθεί με πιο επιθετικό προφίλ ΜΜΚΠ. Το δεύτερο βασικό
σηματοδοτικό μονοπάτι που ενεργοποιείται από το πολυόμα middle T antigen (MT) είναι το
phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K), το οποίο καταλήγει, μέσω της Akt, σε φοσφωρυλίωση του
Bcl-2-associated death agonist (BAD), ο οποίος με τη σειρά του επαναφέρει τα αντι-αποπτωτικά
αποτελέσματα της BAD-binding protein BCL-XL. Ενδιαφέρον προκαλεί επίσης η αναλογία &λτ1 της
έκφρασης των γονιδίων Bax/Bcl-2, όπως στα MCPyV θετικά δείγματα ΜΜΚΠ, υποδεικνύοντας
υπερέκφραση του Bcl-2 και απώλεια του Bax σε σχέδη με το φυσιολογικό βρογχικό επιθήλιο. Η
αναλογία αυτή έχει σχετισθεί με αυξημένη δριμύτητα προνεοπλασματικών βλαβών.
Στη συνέχεια, έγινε ανάλυση επιγενετικών παραμέτρων που σχετίζονται με την παρουσία
MCPyV στα δείγματα ΜΜΚΠ. Τα αυξημένα επίπεδα του miR-21 στα MCPyV θετικά δείγματα
ΜΜΚΠ, ενός miRNA που έχει αναγνωρισθεί ως ο καλύτερος αντιπρόσωπος των σχετιζόμενων με τον καρκίνο miRNAs και που θεωρείται ότι αποτελεί κακό προγνωστικό δείκτη επιβίωσης στον
ΜΜΚΠ, σχετίστηκαν με τα απορυθμισμένα γονίδια στόχους στην παρούσα μελέτη. Τα χαμηλά
επίπεδα Pten – υψηλά επίπεδα miR-21 στα MCyPv θετικά δείγματα ΜΜΚΠ μπορεί να
υποδεικνύουν πτωχή κλινική απάντηση σε Tyrosine Kinase Inhibitor (TKI) και μικρότερη
επιβίωση. Τα υψηλά επίπεδα Braf στα θετικά δείγματα MCPyV, συγκριτικά με τα MCPyV
αρνητικά, σε συνδυασμό με τα χαμηλά επίπεδα Pten προτείνουν μια πιο επιθετική συμπεριφορά
του ΜΜΚΠ παρουσία MCPyV. Επίσης, τα χαμηλά επίπεδα p53 στα MCPyV θετικά δείγματα
ΜΜΚΠ– χαρακτηριστικό της αναστολής του p53 από τους πολυόμα ιούς – συνάδουν με μελέτες
που προτείνουν ότι η αναστολή του miR-21 είναι ευεργετική σε θεραπείες που προκαλούν
απόπτωση ενάντια σε p53-ελλειπείς όγκους. Τέλος, τα χαμηλά επίπεδα Timp3, όπως των MCPyV
θετικών ΜΜΚΠ συγκριτικά με τους μάρτυρες της παρούσας μελέτης, έχουν προταθεί ότι
προωθούν την κακοήθεια και την υποτροπή των συμπτωμάτων σε ασθενείς με HPV-μολυσμένο
ΜΜΚΠ. Συνολικά, τα αποτελέσματα αυτά προτείνουν ένα πτωχότερο προσδόκιμο παρουσία
MCPyV στον ΜΜΚΠ, μέσω του miR-21.
To miR-376c, σημαντικά υπερεκφρασμένο στα MCPyV θετικά ΜΜΚΠ, σχετίσθηκε
αρνητικά με όλα τα γονίδια στόχους του Alk7, Mmp9 και Grb2 (όλα υποεκφρασμένα στα θετικά
MCPyV δείγματα). Το miR-376c έχει ενοχοποιηθεί για κακή απάντηση στη χημειοθεραπεία, μέσω
της αναστολής του Alk7 σε καρκίνο ωοθηκών, ενώ το Mmp9 (γνωστό ότι προάγει τη μετάσταση
στον καρκίνο του πνεύμονα) έχει προταθεί ως πιθανός θεραπευτικός στόχος.
Η υποέκφραση του γνωστού ογκοκατασταλτικού miR-145 σχετίστηκε θετικά με την ύπαρξη
MCPyV, όπως και η υπερέκφραση των γονιδίων στόχων του, Oct4/Sox2/Fascin1. Μελέτες έχουν
δείξει ότι η έκφραση του miR-145 σχετίζεται αρνητικά με τα επίπεδα Oct4/Sox2/Fascin1 σε
αδενοκαρκίνωμα πνεύμονα και ότι ο φαινότυπος Oct4(high)Sox2(high)Fascin1(high)miR145(low),
όπως και στην παρούσα μελέτη, είναι δείκτης κακής πρόγνωσης.
Η καρκινογένεση του πνεύμονα ξεκινά από την αναπνευστική οδό των ασθενών. Είναι
σημαντικό να εδραιωθεί ένας επακόλουθος ρόλος όλων των παραγόντων κινδύνου που
περιπλέκονται στην κυτταρική μετάλλαξη, περιλαμβανομένων και των ιών για την καλύτερη
κατανόηση της επίπτωσης αυτής της ασθένειας στους μη καπνιστές. Οι επιγενετικές αλλαγές στα
καρκινικά κύτταρα ΜΜΚΠ που προκαλούνται από την παρουσία γενομικού υλικού MCPyV, το
προφίλ έκφρασης γονιδίων που σχετίζονται με τον κυτταρικό κύκλο καθώς και τα προφίλ
έκφρασης των microRNAs οδηγούν στην υπόθεση ότι η παρουσία του Merkel Cell Polyoma Virus
μπορεί να οδηγεί σε ένα περισσότερο επιθετικό ΜΜΚΠ, καθώς και σε πτωχότερη έκβαση και
πρόγνωση στον ΜΜΚΠ. Τα αποτελέσματα αυτά εμπλέκουν για πρώτη φορά τα miR21, miR376c και miR145 και τη
συσχέτιση με τα γονίδια στόχους τους, παρουσία του MCPyV, με τον ανθρώπινο ΜΜΚΠ,
προτείνοντας ένα μηχανισμό ρύθμισης της microRNA υπογραφής ειδικό ως προς τον ιό στον
ΜΜΚΠ. Το miR21 –ήδη σχετιζόμενο με κακή πρόγνωση ασθενών με ΜΜΚΠ – και η
απορρύθμιση του σε MCPyV θετικά δείγματα ΜΜΚΠ μπορεί να παίζει σημαντικό ρόλο στη
γένεση, ανάπτυξη και εξέλιξη του καρκίνου. Καθώς ένα μόνο microRNA μπορεί να αναστείλει έως
και αρκετές εκατοντάδες mRNAs, η miRNA έκφραση μπορεί να καταστέλλει μια πληθώρα
μετάγραφα και να επηρεάζει σε βάθος τα μονοπάτια σχετιζόμενα με τον καρκίνο – έτσι, τα
παρόντα αποτελέσματα θα πρέπει να ερμηνευτούν με προσοχή. Περαιτέρω έρευνα, ειδικά σχετικά
με της θεραπευτικές παρεμβάσεις, είναι απαραίτητη για τη διαλεύκανση των επιγενετικών
μηχανισμών που εμπλέκονται στη θανατηφόρα αυτή ασθένεια.
|
Πολυόμα ιοί και καρκίνος του πνεύμονα : παθογένεση και κλινική σημασία
