| Περίληψη |
Η πρόοδος του κυτταρικού κύκλου ελέγχεται από τις κινάσες που εξαρτώνται από κυκλίνες (CDKs). Οι κινάσες αυτές είναι οι καταλυτικοί συνεργάτες των κυκλινών. Το γονίδιο p21 χαρακτηρίσθηκε ως πρωτεϊνη που συνδέεται στο σύμπλοκο κινάσης-κυκλίνης και αποδείχθηκε σημαντικός παράγοντας για τη ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου, καθώς η έκφρασή του που προέρχεται από μιτιγόνα ερεθίσματα οδηγεί σε αναστολή του κυτταρικού κύκλου στη φάση G1. Το γονίδιο p21 αποτελεί στόχο διαφόρων σημάτων που προάγουν την αναστολή της ανάπτυξης και τη διαφοροποίηση. Η μεταγραφική ρύθμιση του p21 ελέγχεται από μηχανισμούς εξαρτημένους από p53 και μηχανισμούς ανεξάρτητους από p53. Μια πληθώρα από μεταγραφικούς παράγοντες συνδέονται σε συγκεκριμένες θέσεις απόκρισης που εντοπίζονται στον υποκινητή του p21 και ρυθμίζουν την έκφραση του p21 με τρόπο ανεξάρτητο του p53. Η περιοχή του p21 υποκινητή μεταξύ των βάσεων -119/+1 περιέχει 6 θέσεις πρόσδεσης του παράγοντα Sp1 και παίζει πρωταρχικό ρόλο στη ρύθμιση της μεταγραφής του p21. Στην παρούσα εργασία κατασκευάσαμε μια σειρά μεταλλαγμένων υποκινητών για κάθε μια από τις Sp1 θέσεις με σκοπό τη μελέτη της σημασίας των θέσεων αυτών στη ρύθμιση του p21. Η σύνδεση του παράγοντα Sp1 με τον αγρίου τύπου και τους μεταλλαγμένους υποκινητές επιβεβαιώθηκε με τη μέθοδο της κινητικότητας συμπλόκου σε πηκτή πολυακρυλαμίδης. Παρατηρήθηκαν, επίσης, διαφορές στην ενεργότητα των μεταλλαγμένων υποκινητών, χρησιμοποιώντας διάφορες κυτταρικές σειρές, όπως HepG2, COS-7 και HeLa. Τέλος, μελετήσαμε το ρόλο του παράγοντα p300 και των πρωτεϊνών SMAD στη μεταγραφή του p21 μέσω του Sp1. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι οι θέσεις αυτές δεν είναι εξίσου ισοδύναμες στη ρύθμιση του p21 και καμία από αυτές δεν είναι αποκλειστικά υπεύθυνη για την ενεργοποίηση μέσω Sp1. Επιπλέον, όλοι οι μεταλλαγμένοι υποκινητές ενεργοποιούνται εξίσου από τις πρωτεϊνες SMADs (2 φορές), υποδεικνύοντας ότι οι SMADs ενεργοποιούν τον p21 υποκινητή μέσω άλλων παραγόντων που αναγνωρίζουν τις πλούσιες σε GC περιοχές. Τέλος, υπάρχουν ενδείξεις για το σχηματισμό ενός πολύ-πρωτεϊνικού συμπλόκου αποτελούμενο από Sp1, p300 και SMADs στην κοντινή περιοχή του p21 υποκινητή , που ελέγχει τη μεταγραφή του p21.
|
Λειτουργικός χαρακτηρισμός των θέσεων πρόσδεσης του παράγοντα Sp1 στον υποκινητή του γονιδίου p21/WAF του ανθρώπου και μελέτη του μηχανισμού μεταγραφικής ενεργοποίησης από τις πρωτεΐνες SMAD και p300
