| Περίληψη |
Στα ζώα η κληρονόμηση του μιτοχονδριακού DNA (mtDNA) είναι μητρική, δηλαδή όλοι οι
απόγονοι φέρουν μόνο το μητρικό μιτοχονδριακό απλότυπο, ή αλλιώς μιτότυπο. Ως αποτέλεσμα
της μητρικής κληρονόμησης του mtDNA, όλοι οι απόγονοι αναμένεται να φέρουν ένα μόνο
μιτότυπο, μια κατάσταση που ονομάζεται ομοπλασμία. Ωστόσο, είναι αρκετά συχνή η
παρατήρηση ατόμων που φέρουν παραπάνω από έναν μιτότυπους, είναι δηλαδή
ετεροπλασμικοί. Η ετεροπλασμία μπορεί να προκύψει με δύο διαφορετικούς τρόπους. Ο
πρώτος είναι μέσω μεταλλαγών που συμβαίνουν στο mtDNA. Ο δεύτερος είναι μέσω
περιστασιακής κληρονόμησης του mtDNA από τον αρσενικό γονέα, ταυτόχρονα με την
κληρονόμηση του μητρικού mtDNA, ένα φαινόμενο που ορίζεται ως διαρροή πατρικού mtDNA.
Η μελέτη της διαρροής του πατρικού mtDNA παρουσιάζει ιδιαίτερο ενδιαφέρον, καθώς μπορεί
να έχει σημαντικό αντίκτυπο στην αρμοστικότητα του mtDNA, αλλά και γενικότερα στην εξέλιξή
του. Πιο συγκεκριμένα, λόγω του αφυλετικού τρόπου μεταβίβασής του το mtDNA συσσωρεύει
γρηγορότερα μεταλλαγές σε σχέση με το πυρηνικό DNA (nDNA), παρ’ όλα αυτά το mtDNA
παραμένει λειτουργικό. Η διαρροή μπορεί να συμβάλλει στη διατήρηση της λειτουργικότητας
του mtDNA, καθώς η συνύπαρξη δύο διαφορετικών μιτότυπων μέσα σε ένα άτομο δημιουργεί
τις κατάλληλες προϋποθέσεις για ανασυνδυασμό, ο οποίος αναστρέφει τη συσσώρευση
επιβλαβών μεταλλαγών σε αυτό. Συνεπώς, η μελέτη της διαρροής και των προτύπων που τη
χαρακτηρίζουν κρίνεται ιδιαίτερα σημαντική.
Στην πρώτη ενότητα πειραμάτων της διατριβής αυτής, χρησιμοποιήθηκαν για τη μελέτη
της ετεροπλασμίας χιμαιρικές γραμμές Drosophila, που δηλαδή έφεραν nDNA από το είδος D.
simulans και mtDNA από το είδος D. melanogaster. Οι γραμμές, που έχουν ένα συγκεκριμένο
πυρηνικό υπόβαθρο, βρέθηκαν μετά από μία διαδικασία αντικατάστασης του mtDNA τους να
είναι ετεροπλασμικές (si και mel μιτότυποι), ενώ γραμμές με άλλα πυρηνικά υπόβαθρα ήταν
ομοπλασμικές για το μιτότυπο που εισάχθηκε. Μετά από μια σειρά πειραμάτων φάνηκε ότι η
εμφάνιση του μιτότυπου mel στα άτομα σχετιζόταν με το Χ χρωμόσωμα της γραμμής DGRP-820,
και μάλιστα με την περιοχή που ορίζεται από τους φαινοτυπικούς δείκτες f και mal. Ωστόσο, το
γεγονός ότι από τις χιμαιρικές και ετεροπλασμικές γραμμές φαινόταν να διαρρέει πάντα μόνο ο
μιτότυπος mel, και όχι ο μιτότυπος si, οδήγησε στην υπόθεση ότι τα παρατηρούμενα πρότυπα
δεν οφείλονται σε πραγματική ετεροπλασμία, αλλά σε τμήμα του mtDNA που έχει εντεθεί στο
nDNA (Nuclear Mitochondrial, NUMT). Για την επίλυση αυτού του ζητήματος σχεδιάστηκε μία
σειρά διαφορετικών πειραμάτων. Τελικά, φάνηκε ότι τα παρατηρούμενα πρότυπα οφείλονται
σε μια ένθεση NUMT σε μια περιοχή μεγέθους 3,15Mb, μεταξύ των δεικτών f και mal του Χ
χρωμοσώματος. Υπολογίστηκε ότι η ένθεση που βρέθηκε είναι τουλάχιστον 16225bp, γεγονός
που το καθιστά το μεγαλύτερου μεγέθους NUMT που έχει βρεθεί για το είδος D. melanogaster.
Τέλος, συμπεράναμε ότι επειδή NUMTs απαντώνται ολοένα και πιο συχνά στα γονιδιώματα,
δεδομένα ετεροπλασμίας πρέπει να αναλύονται με προσοχή προκειμένου να αποφεύγεται η
σύγχυση πραγματικής ετεροπλασμίας και πλασματικής ετεροπλασμίας λόγω NUMT.
Στην επόμενη ενότητα πειραμάτων, έγινε προσπάθεια να ανιχνευθεί το NUMT που
αναφέρεται παραπάνω στο πλήρως αλληλουχημένο γονιδίωμα της γραμμής DGRP-820 με μια
βιοπληροφορική προσέγγιση. Ειδικότερα, χρησιμοποιήθηκαν δεδομένα αλληλούχησης της
γραμμής DGRP-820 κατατεθειμμένα σε βάση δεδομένων με σκοπό την αναζήτηση χιμαιρικών
αναγνωσμάτων που ένα μέρος τους στοιχίζεται στο Χ χρωμόσωμα και ένα άλλο μέρος τους
στοιχίζεται στο mtDNA. Τέτοια αναγνώσματα αναμένεται να αντιστοιχούν στα άκρα της ένθεσης
που αναζητείται. Για την ανάλυση χρησιμοποιήθηκαν τα αχαρτογράφητα αναγνώσματα που
προέκυψαν μετά από στοίχιση με γονιδίωμα αναφοράς. Σε αυτά τα αναγνώσματα εφαρμόστηκε
ο αλγόριθμος BLAST, ώστε να βρεθούν εκείνα που έχουν ομοιότητες και με το Χ χρωμόσωμα και
με το mtDNA. Στα αποτελέσματα που προέκυψαν εφαρμόστηκαν φίλτρα προκειμένου να
χαρακτηριστούν ζεύγη χιμαιρικών αναγνωσμάτων που θα αντιστοιχούσαν στα άκρα της
ένθεσης. Τα αποτελέσματα που προέκυψαν, ωστόσο, δεν ήταν δυνατό να περιοριστούν σε
σημαντικό βαθμό ώστε να προκύψουν αναγνώσματα που θα είχαν τα χαρακτηριστικά που
αναμένεται να έχουν όντας στα άκρα της ένθεσης. Επιπλέον, θετικός μάρτυρας που αναλύθηκε
παράλληλα με τα άλλα αναγνώσματα, έδειξε ότι πιθανότατα τα χιμαιρικά αναγνώσματα που
αντιστοιχούν στην ένθεση απορρίπτονται σε κάποιο σημείο της ανάλυσης. Υποθέτουμε ότι
κύριος υπαίτιος για την αποτυχία της μεθόδου είναι το πολύ μικρό μέγεθος των αναγνωσμάτων
που χρησιμοποιήθηκαν σε συνδυασμό με το μεγάλο μέγεθος της ένθεσης.
Στην τελευταία ενότητα πειραμάτων χρησιμοποιήθηκαν μύγες Drosophila συλλεγμένες
από φυσικό πληθυσμό προκειμένου να διαπιστώσουμε αν υπάρχουν διαφορές στη συχνότητα που παρατηρείται διαρροή λόγω του διαφορετικού υπόβαθρού που έχουν οι μύγες. Για το
σκοπό αυτό κατασκευάστηκαν ισοθηλυκές γραμμές του είδους D. simulans, θηλυκά από τις
οποίες διασταυρώθηκαν με αρσενικά άτομα του εργαστηριακού είδους D. mauritiana.
Συνολικά, ελέγχθηκαν για ετεροπλασμία 2292 άτομα που προέρχονταν από 15 ισοθηλυκές
γραμμές. Από τη στατιστική ανάλυση των αποτελεσμάτων προέκυψε ότι στα αρσενικά από τρεις
ισοθηλυκές γραμμές απαντάται διαρροή με μεγαλύτερη συχνότητα σε σχέση με κάποιες άλλες
γραμμές. Αντίστοιχη διαφορά παρατηρήθηκε και μετά την ανάλυση της συχνότητας της
διαρροής αυτή τη φορά στο σύνολο των απογόνων. Επιπλέον, στους απογόνους που
προέρχονταν από δύο συγκεκριμένες ισοθηλυκές γραμμές δεν παρατηρήθηκε διαφορά στα
ποσοστά ετεροπλασμίας μεταξύ θυληκών και αρσενικών, όπως αναμενόταν από προηγούμενες
μελέτες. Από τα αποτελέσματα συμπεράναμε ότι η διαρροή πατρικού mtDNA σχετίζεται άμεσα
με τα διαφορετικά πυρηνικά υπόβαθρα των ισοθηλυκών γραμμών D. simulans, υποδεικνύοντας
ότι η διαρροή δεν είναι ένα τυχαίο γεγονός που προκύπτει από την αποτυχία των μηχανισμών
που αποκλείουν την κληρονόμηση του πατρικού mtDNA, αλλά μια διαδικασία που ελέγχεται
από το nDNA.
|
Μελέτη της ετεροπλασμίας του μιτοχονδριακού DNA σε εργαστηριακά στελέχη Drosophila και σε φυσικούς υβριδικούς πληθυσμούς
