| Περίληψη |
Η παρούσα εργασία αφορά την μελέτη της ισομορφής Μ2 του μεταβολικού παράγοντα της πυροσταφυλικής κινάσης (PKM2) και του αντιοξειδωτικού πυρηνικού παράγοντα 2 (Nrf2). Οι δύο παραπάνω πρωτεΐνες έχουν ήδη χαρακτηρισθεί ως βασικά ρυθμιστικά μόρια του μεταβολικού φαινοτύπου των καρκινικών κυττάρων, δίχως όμως η αλληλεπίδραση τους να έχει διευκρινιστεί επαρκώς. Από τη μία πλευρά, τα καρκινικά κύτταρα που έχουν αυξημένες ενεργειακές και βιοσυνθετικές ανάγκες, απαιτούν την αυξημένη πρόσληψη γλυκόζης και την αξιοποίηση της σε αναβολικές διεργασίες μέσω ενός μηχανισμού που καλείται «αερόβια γλυκόλυση» ή “Warburg effect”. Σε αυτό το φαινόμενο κυρίαρχο ρόλο έχει η πυροσταφυλική κινάση PKM2, η οποία εμφανίζεται σε δύο κύριες στερεοδιατάξεις, ως διμερής και ως τετραμερής μορφή και συμμετέχει στο τελευταίο και καθοριστικό στάδιο της γλυκόλυσης για τη μετατροπή του φώσφο-ενολ-πυροσταφυλικό (PEP) σε πυροσταφυλικό. Η τετραμερής μορφή χαρακτηρίζεται από την υψηλή καταλυτική της δράση και εμπλέκεται σε καταβολικές διεργασίες, ενώ η διμερής μορφή έχει χαμηλή καταλυτική δράση και συνεισφέρει επάγοντας γλυκολυτικά μονοπάτια και έμμεσα τη σύνθεση μακρομορίων για την κυτταρική αύξηση και πολλαπλασιασμό και την εξουδετέρωση του ενδοκυττάριου οξειδωτικού φορτίου. Όταν η PKM2 βρίσκεται κυρίως στην διμερή μορφή της όλα τα γλυκολυτικά ενδιάμεσα πάνω από την κινάση του πυροσταφυλικού, συσσωρεύονται και είναι διαθέσιμα ως πρόδρομες ενώσεις για την βιοσυνθετική διαδικασία προκειμένου να ανταπεξέλθουν στις αυξημένες μεταβολικές τους ανάγκες. Από την άλλη πλευρά, το οξειδωτικό στρες, που προκαλείται από τη συσσώρευση οξειδωτικών ριζών οξυγόνου και αζώτου (ROS & RNS), ενδέχεται να προκαλέσει σοβαρές και μη αναστρέψιμες ενδοκυττάριες βλάβες, όπως μεταλλάξεις του γονιδιώματος, αποδιάταξη πρωτεϊνών και οξείδωση λιπιδίων που δυνητικά θα οδηγήσουν σε κυτταρικό θάνατο. Κεντρικό μόριο του μεταβολισμού του οξειδωτικού φορτίου (redox metabolism) είναι ο πυρηνικός μεταγραφικός παράγοντας Nrf2, ο οποίος ανήκει στο ενδοκυττάριο σηματοδοτικό μονοπάτι Nrf2-Keap1-ARE και επάγει τη μεταγραφή αντιοξειδωτικών και αποτοξινωτικών γονιδίων. Ο Nrf2 σε συνθήκες μειωμένου οξειδωτικού φορτίου, βρίσκεται στο κυτταρόπλασμα δεσμευμένος με τον αναστολέα του Keap1 και οδηγείται σε πρωτεασωμική αποικοδόμηση μέσω ουβικιτινιλίωσης. Μόλις το οξειδωτικό φορτίο αυξηθεί, ο Nrf2
7
αποδεσμεύεται και μεταφέρεται στον πυρήνα, όπου συμμετέχει στη μεταγραφή αντιοξειδωτικών γονιδίων με την αλληλουχία ARE στον υποκινητή τους. Ενώ ο Nrf2 σε πρώιμα στάδια καρκινογένεσης διατηρεί χημειοπροστατευτική δράση, σε προχωρημένα στάδια φαίνεται προσδίδει στα καρκινικά κύτταρα πλεονέκτημα επιβίωσης, επιτρέποντας την επιβίωση τους ακόμη και σε συνθήκες με υψηλό οξειδωτικό φορτίο, όπως για παράδειγμα σε έκθεση των κυττάρων σε χημειοθεραπεία ή/και ακτινοθεραπεία. Αυτό το χαρακτηριστικό, καθώς και την αυξημένη βιοσυνθετική ικανότητα μέσω του Warburg effect και της σχετιζόμενης με αυτό PKM2, εκμεταλλεύονται τα καρκινικά κύτταρα για να αποκτήσουν πλεονέκτημα επιβίωσης έναντι των υγιών. Στόχος της παρούσας μελέτης είναι η διερεύνηση πιθανής αλληλεπίδρασης μεταξύ PKM2 και Nrf2 και τα αποτελέσματα αυτής στην αντίσταση των καρκινικών κυττάρων στα χημειοθεραπευτικά φάρμακα Oxaliplatin και 5FU. Η πειραματική διαδικασία περιλαμβάνει τεχνικές κυτταροκαλλιέργειας και μέτρηση επιβίωσης των κυττάρων (Cell Viability Assay). Αναδείχθηκαν οι βέλτιστες συγκεντρώσεις των χημειοθεραπευτικών φαρμάκων σε κυτταρικές σειρές καθώς και η επίδραση τους σε αυτές απαγωγέων και αναστολέων των PKM2-Nrf2 (HT-29, LoVo, CoLo205, SW480, CCD112, A549 και SKOV3). Στην πορεία, τεχνικές ανοσοκαθήλωσης ,όπως ο ανοσοφθορισμός, έδωσαν χρήσιμες πληροφορίες για την υποκυτταρική εντόπιση των πρωτεϊνών Νrf2, PKM2 και άλλων σχετιζόμενων πρωτεϊνών, αλλά και την “cross – talk” σχέση τους πριν και μετά τη χορήγηση θεραπείας, ενώ η πληροφορία για την ποσοτική μελέτη της έκφρασης των πρωτεϊνών ενδιαφέροντος λήφθηκε από την τεχνική Western blot.
|
Μελέτη της αλληλεπίδρασης της PKM2 του μεταβολικού μονοπατιού και του αντιοξειδωτικού Nrf2 στην αντίσταση στη χημειοθεραπεία με βάση την οξαλιπλατίνη και το 5FU σε καρκινικά κύτταρα
