Your browser does not support JavaScript!

Αρχική    Ανάπτυξη νέων παραμέτρων στις κατασκευές ιογε΄νων φορέων για τη βελτίωση της γονιδιακής μεταφοράς και έκφρασης σε αιμοποιητικά κύτταρα  

Αποτελέσματα - Λεπτομέρειες

Προσθήκη στο καλάθι
[Προσθήκη στο καλάθι]
Κωδικός Πόρου uch.med.phd//2004DIS1201
Τίτλος Ανάπτυξη νέων παραμέτρων στις κατασκευές ιογε΄νων φορέων για τη βελτίωση της γονιδιακής μεταφοράς και έκφρασης σε αιμοποιητικά κύτταρα
Συγγραφέας Φράγκος, Μιχάλης
Περίληψη Οι ογκορετροϊικοί φορείς γ-σφαιρίνης αποτελούν ένα από τα πιο κατάλληλα μέσα μεταφοράς του γονιδίου της γ-σφαιρίνης σε αιμοποιητικά κύτταρα, με στόχο την γονιδιακή θεραπεία των αιμοσφαιρινοπαθειών. Βασικά μειονεκτήματα των φορέων αυτών αποτελούν η χαμηλή έκφραση και η αποσιώπηση του μεταφερόμενου γονιδίου. Τα προβλήματα αυτά έχουν αντιμετωπιστεί στην περίπτωση των διαγονιδιακών ποντικών και των λεντιικών φορέων με τη χρήση στοιχείων από την περιοχή LCR (Locus Control Region) του συμπλέγματος των γονιδίων της β-σφαιρίνης του ανθρώπου. Η ένθεση όμως τέτοιων στοιχείων σε ογκορετροϊικούς φορείς οδηγεί σε γενετική αστάθεια και χαμηλούς τίτλους. Για το λόγο αυτό πολλές ερευνητικές ομάδες στράφηκαν στο στοιχείο HS-40, από το σύμπλεγμα των γονιδίων της α-σφαιρίνης του ανθρώπου, ως εναλλακτικό ερυθρό-ειδικό ενισχυτή, και στο μονωτή cHS4 από το σύμπλεγμα των γονιδίων της β-σφαιρίνης του κοτόπουλου, ως μέσο για τη μείωση της αποσιωπητικής επίδρασης της θέσης ένθεσης του φορέα. Ακόμα όμως και με αυτές τις βελτιώσεις, η έκφραση της γ-σφαιρίνης έφτασε σε επίπεδα μικρότερα από αυτά που απαιτούνται για τη θεραπεία των αιμοσφαιρινοπαθειών. Προς την κατεύθυνση της λύσης των προβλημάτων αυτών, στην παρούσα μελέτη χρησιμοποιήθηκε ένα ρυθμιστικό στοιχείο που προήλθε από μελέτες σε άτομα με το σύνδρομο κληρονομικής παραμονής της εμβρυϊκής αιμοσφαιρίνης (Hereditary Persistence of Fetal Hemoglobin, HPFH), τα οποία χαρακτηρίζονται από υψηλά επίπεδα έκφρασης της εμβρυϊκής γ-σφαιρίνης σε ενήλικο στάδιο. Η κατάσταση HPFH προκαλείται είτε από σημειακές μεταλλάξεις, είτε από ελλείμματα μεγάλων τμημάτων DNA που απομακρύνουν το γονίδιο της β-σφαιρίνης. Στην τελευταία περίπτωση, γνωστή ως ελλειμματική HPFH, το γ-γονίδιο ενεργοποιείται από τη διαμετάθεση στοιχείων με ενισχυτική δράση που βρίσκονται στην παρακείμενη περιοχή. Ένα από τα στοιχεία αυτά είναι ένα τμήμα 722 νουκλεοτιδίων που διαμετατίθεται δίπλα στο γονίδιο της Αγ-σφαιρίνης στην κατάσταση HPFH τύπου ΙΙ. Tο στοιχείο αυτό, που στην παρούσα μελέτη ονομάζεται HPFH-2, είχε δειχθεί από την ερευνητική μας ομάδα να έχει δράση ενισχυτή σε διαγονιδιακά ποντίκια. Ο ενισχυτής HPFH-2 χρησιμοποιήθηκε σε μια σειρά από ογκορετροϊικούς φορείς για τη μεταφορά και την έκφραση του γονιδίου της Αγ-σφαιρίνης σε αιμοποιητικά κύτταρα. Πριν τη χρήση του στους φορείς αυτούς, πραγματοποιήθηκε λειτουργική μελέτη του ενισχυτή. Αρχικά μελετήθηκε η αλληλεπίδραση του με το μικρό (- 382) και το μεγάλο (-1350) υποκινητή του γονιδίου της Αγ-σφαιρίνης, καθώς και με την περιοχή LCR. Για το σκοπό αυτό πραγματοποιήθηκαν μόνιμες διαμολύνσεις της κυτταρικής σειράς MEL585 με πλασμιδιακούς φορείς που περιέχουν είτε τον -382 είτε τον -1350 Αγ-υποκινητή παρουσία ή μη της περιοχής LCR και του ενισχυτή HPFH-2. Παράλληλα με τα πλασμίδια αυτά πραγματοποιήθηκε συνδιαμόλυνση με φορέα που περιέχει το γονίδιο ανθεκτικότητας στο αντιβιοτικό G418. Στη συνέχεια, απομονώθηκαν και συγκαλλιεργήθηκαν τουλάχιστον 50 ανθεκτικές MEL αποικίες για κάθε φορέα, για να δημιουργηθούν 5 έως 9 διαφορετικοί πληθυσμοί (pools) για κάθε φορέα. Οι πληθυσμοί αυτοί στη συνέχεια υποβλήθηκαν σε επαγωγή προκειμένου να εκφράσουν το διαγονίδιο της γ-σφαιρίνης και μελετήθηκαν ως προς την έκφραση του διαγονιδίου με τη μέθοδο προστασίας με RNάση. Ο αριθμός των αντιγράφων του διαγονιδίου ανά κύτταρο MEL προσδιορίστηκε με υβριδοποίηση κατά Southern και τα αποτελέσματα διορθώθηκαν με βάση τον αριθμό των αντιγράφων. Οι φορείς που δεν περιλαμβάνουν την περιοχή LCR οδήγησαν σε πολύ μικρή έως μηδενική έκφραση. Οι φορείς με τον -1350 Αγ-υποκινητή που περιέχουν την LCR οδήγησαν σε υψηλή έκφραση, είτε παρουσία είτε απουσία του ενισχυτή HPFH-2. Τέλος οι φορείς που περιέχουν τον -382 Αγ-υποκινητή παρουσία της LCR περιοχής οδήγησαν σε χαμηλή έκφραση απουσία του HPFH-2, ενώ παρουσία του ενισχυτή η έκφραση αυξήθηκε σημαντικά, φτάνοντας σε υψηλά επίπεδα. Τα αποτελέσματα αυτά δείχνουν ότι ο HPFH-2 αυξάνει σημαντικά την έκφραση του εμβρυϊκού γ-γονιδίου σε ενήλικο περιβάλλον, όταν το γονίδιο μεταγράφεται από -382 Αγ-υποκινητή. Για τον λόγο αυτό αποφασίστηκε ο ενισχυτής HPFH-2 να χρησιμοποιηθεί σε ογκορετροϊικό φορέα σε συνδυασμό με τον -382 Αγ-υποκινητή, ο οποίος φαίνεται να αλληλεπιδρά ικανοποιητικά με τον ενισχυτή HPFH-2. Ο ενισχυτής HPFH-2 μελετήθηκε επίσης και με πειράματα ενεργότητας της λουσιφεράσης με σκοπό τον εντοπισμό και τη μελέτη του λειτουργικού στοιχείου του ενισχυτή. Έτσι κατασκευάστηκε μια σειρά πλασμιδιακών φορέων που περιέχουν το γονίδιο της λουσιφεράσης, κάτω από τον έλεγχο του υποκινητή του γονιδίου της γ-σφαιρίνης, και τμήματα του ενισχυτή HPFH-2 που κλωνοποιήθηκαν κάτωθεν του γονιδίου αναφοράς. Οι φορείς αυτοί χρησιμοποιήθηκαν για την διαμόλυνση αιμοποιητικών κυττάρων Κ562 και κυττάρων HeLa. Τα αποτελέσματα των μετρήσεων της ενεργότητας της λουσιφεράσης έδειξαν ότι ο ενισχυτής HPFH-2 είναι ερυθρό-ειδικός και ότι το λειτουργικό του στοιχείο αποτελείται από τις GATA-1 και CCAAT θέσεις που βρίσκονται στο AccI-AccI τμήμα του ενισχυτή. Με βάση τη γνώση που προήλθε από τα πειράματα μονίμων διαμολύνσεων των κυττάρων MEL, χρησιμοποιήθηκε μία τροποποιημένη κασέτα Αγ-γονιδίου με υποκινητή 382 bp, σε ένα ογκορετροϊικό φορέα όπου το γονίδιο της ανθεκτικότητας στην νεομυκίνη (Neo) μεταγράφεται από την ιική μακρά τελική επαναληπτική αλληλουχία (LTR). Προκειμένου να ελαχιστοποιηθεί η πιθανότητα μεταγραφικής σιγής από φαινόμενα επίπτωσης της θέσης ενσωμάτωσης, η κατασκευή του φορέα πλαισιώθηκε από δύο αντίγραφα του μονωτή χρωματίνης cHS4. Στο βασικό αυτό φορέα, υποκλωνοποιήθηκαν είτε ο ενισχυτής HS-40 (φορέας AγHS40), είτε ο ενισχυτής HPFH-2 (φορέας AγHPFH2) και ακολούθησε συσκευασία για την παραγωγή ιικών φορέων. O φορέας AγHS40 απεδείχθη γενετικά σταθερός με τίτλο 1x105 cfu/ml, ενώ ο φορέας AγHPFH2 μετρίως σταθερός με τίτλο 5x103 cfu/ml. Oι δύο φορείς χρησιμοποιήθηκαν περαιτέρω για τη μεταγωγή των κυττάρων MEL και ακολούθησε απομόνωση κλώνων ανθεκτικών στη νεομυκίνη. Oι απομονωθέντες κλώνοι υπεβλήθησαν σε επαγωγή και ακολούθως αναλύθηκαν για την έκφραση της γ-σφαιρίνης με ανοσοφθορισμό και κυτταρομετρία ροής. Για το φορέα AγHS40, από τους 12 κλώνους, 4 εξέφρασαν γ-σφαιρίνη με ομοιόμορφο πρότυπο, 6 κλώνοι εξέφρασαν με ανομοιόμορφο πρότυπο, ενώ 2 δεν εξέφρασαν καθόλου. Για το φορέα AγHPFH2, 8 από τους 10 κλώνους που περιείχαν άθικτο προϊό εξέφρασαν γ-σφαιρίνη με ομοιόμορφο πρότυπο, ενώ οι υπόλοιποι κλώνοι την εξέφρασαν με ανομοιόμορφο πρότυπο. Aνάλυση στο επίπεδο του mRNA τεκμηρίωσε την έκφραση του γ-γονιδίου στο φορέα AγHS40 και στο φορέα AγHPFH2, με μέσο όρο 42% και 126% ανά αντίγραφο α-σφαιρίνης ποντικού αντίστοιχα, σε όλους τους κλώνους με άθικτο αντίγραφο προϊού. Tα αποτελέσματα αυτά αποδεικνύουν ότι ο ενισχυτής HPFH-2 έχει την ικανότητα να αυξάνει την πιθανότητα και τα επίπεδα έκφρασης του εμβρυϊκού γ-γονιδίου, και ότι η δραστικότητα αυτή είναι τουλάχιστον τόσο ισχυρή όσο εκείνη του ενισχυτή HS-40. Tα δεδομένα αυτά επέτρεψαν το σχεδιασμό νέων μελετών για τη βελτίωση των παραμέτρων των φορέων, όπως η διερεύνηση της δυνητικής συνέργειας των δύο ενισχυτών HS-40 και HPFH-2, καθώς και της ικανότητας του ενισχυτή HPFH-2 να αλληλεπιδρά με τον υποκινητή του β-γονιδίου, ο οποίος είναι λιγότερο επιρρεπής στη μεταγραφική σιγή σε ενήλικο ερυθροποιητικό περιβάλλον. Προς αυτή την κατεύθυνση κατασκευάστηκε αρχικά ο φορέας AγHS40-HPFH2, ο οποίος περιλαμβάνει τον -382 Αγ-υποκινητή με τους ενισχυτές HS-40 και HPFH-2. O φορέας αυτός ήταν γενετικά ασταθής, λόγω ελλείμματος της περιοχής μεταξύ του HPFH-2 ενισχυτή και του Αγ-υποκινητή. Για το λόγο αυτό στη συνέχεια κατασκευάστηκαν νέοι φορείς που περιέχουν μικρότερο ή διαφορετικό υποκινητή, με στόχο την αποφυγή της γενετικής αστάθειας. O φορέας Aγ201HS40-HPFH2 περιέχει τον -201 Αγ-υποκινητή και είναι γενετικά σταθερός με τίτλο 6x105 cfu/ml. O φορέας Aγ117HS40-HPFH2, ο οποίος περιέχει τον -201 Αγ-υποκινητή με την Eλληνική μετάλλαξη στο σημείο -117, είναι γενετικά σταθερός με τίτλο 1x106 cfu/ml. Tέλος, ο φορέας AγβHS40-HPFH2, ο οποίος περιέχει τον -127 β-υποκινητή, είναι γενετικά σταθερός με τίτλο 7x105 cfu/ml. Oι φορείς αυτοί χρησιμοποιήθηκαν για την μεταγωγή κυττάρων MEL και ακολούθησε απομόνωση κλώνων ανθεκτικών στην νεομυκίνη, οι οποίοι στη συνέχεια υποβλήθηκαν σε επαγωγή και αναλύθηκαν ως προς την έκφραση της γ-σφαιρίνης με ανοσοφθορισμό και κυτταρομετρία ροής. O φορέας Aγ201HS40-HPFH2 οδήγησε σε χαμηλή έκφραση, ο φορέας Aγ117HS40-HPFH2 σε υψηλή και ομοιογενή έκφραση, ενώ ο φορέας AγβHS40-HPFH2 σε εντυπωσιακά υψηλή αλλά ανομοιογενή έκφραση. Πραγματοποιήθηκαν επίσης πειράματα προστασίας με RNάση, τα οποία έδειξαν ότι ο φορέας Aγ201HS40-HPFH2 εκφράζει το διαγονίδιο κατά 28.4% της ενδογενούς έκφρασης του ενός αντιγράφου του γονιδίου της α-σφαιρίνης του ποντικού, ο φορέας Aγ117HS40-HPFH2 το εκφράζει κατά 248% και ο φορέας AγβHS40-HPFH2 κατά 191.9%. Tα αποτελέσματα αυτά δείχνουν ότι η Eλληνική μετάλλαξη στο σημείο -117 του γ-υποκινητή σε συνδυασμό με τους δύο ενισχυτές όχι μόνο αυξάνει σημαντικά την έκφραση του διαγονιδίου, αλλά και αποτρέπει την αποσιώπησή του. Τέλος, ο ρετροϊικός φορέας Aγ117HS40-HPFH2 χρησιμοποιήθηκε για τη μόλυνση κυττάρων μυελού των οστών από ποντικούς, τα οποία στη συνέχεια μεταμοσχεύθηκαν σε ακτινοβολημένα συγγενή ποντίκια. Η αποτελεσματικότητα της μόλυνσης των κυττάρων του μυελού υπολογίστηκε με την καταμέτρηση αποικιών CFU-GM που είναι ανθεκτικές στο αντιβιοτικό G418. Tα πειράματα αυτά έδειξαν ότι η μεταφορά του φορέα Aγ117HS40-HPFH2 στα κύτταρα αυτά ήταν χαμηλή. Η ένθεση του φορέα στα αιμοποιητικά κύτταρα των μεταμοσχευμένων ποντικών μελετήθηκε με PCR και επιβεβαιώθηκε στα περισσότερα πειραματόζωα. Η έκφραση του διαγονιδίου της Αγ-σφαιρίνης μελετήθηκε ανά μηνιαία χρονικά διαστήματα με ανοσοφθορισμό και κυτταρομετρία ροής. Η ανάλυση που πραγματοποιήθηκε έδειξε ότι το ποσοστό των κυττάρων που εκφράζουν το διαγονίδιο είναι μικρό και ότι η έκφραση του διαγονιδίου σταματά 5-6 μήνες μετά τη μεταμόσχευση. Μετά από 6 μήνες ανάλυσης τα πειραματόζωα θυσιάστηκαν και απομονώθηκε DNA από τους σπλήνες των ζώων, για την πραγματοποίηση υβριδοποίησης κατά Southern και τον υπολογισμό του αριθμού των αντιγράφων του διαγονιδίου στα αιμοποιητικά κύτταρα των ποντικών. Το πείραμα αυτό έδειξε ότι η μεταφορά του φορέα ήταν μεν ασθενής, αλλά επιτυχής για τα περισσότερα πειραματόζωα. Με βάση τον αριθμό των αντιγράφων του διαγονιδίου στα αιμοποιητικά κύτταρα των μεταμοσχευμένων ποντικών, πραγματοποιήθηκε διόρθωση των αποτελεσμάτων κυτταρομετρίας ροής, έτσι ώστε να υπολογιστεί το ποσοστό των κυττάρων εκείνων που περιέχουν τον ρετροϊικό φορέα και εκφράζουν το διαγονίδιο. Το ποσοστό αυτό έφτασε το 10.42% των κυττάρων του περιφερικού αίματος, γεγονός που δείχνει ότι αν η μεταφορά του φορέα στα πρώιμα αιμοποιητικά κύτταρα βελτιωθεί, ο φορέας Aγ117HS40-HPFH2 μπορεί να αποτελέσει ένα ιδανικό μέσο για τη μεταφορά και έκφραση του γονιδίου της γ-σφαιρίνης σε αιμοποιητικά κύτταρα, με σκοπό τη γονιδιακή θεραπεία των αιμοσφαιρινοπαθειών.
Γλώσσα Ελληνικά
Ημερομηνία έκδοσης 2004-12-01
Συλλογή   Σχολή/Τμήμα--Σχολή Επιστημών Υγείας--Τμήμα Ιατρικής--Διδακτορικές διατριβές
  Τύπος Εργασίας--Διδακτορικές διατριβές
Εμφανίσεις 45

Ψηφιακά τεκμήρια
No preview available