| Περίληψη |
Ο Mac1 αποτελεί χαλκορυθμιζόμενο μεταγραφικό παράγοντα του Saccharomyces cerevisiae. Ως ρόλο έχει τη ρύθμιση γονιδίων (CTR1, CTR3, FRE1, FRE7), οι πρωτεΐνες των οποίων είναι υπεύθυνες για την είσοδο του χαλκού στο κύτταρο. Η Μac1 περιλαμβάνει περιοχή υπεύθυνη για την πρόσδεση της στο DNA καθώς και περιοχή ρύθμισης της μεταγραφής εξαρτώμενη από την διαθεσιμότητα του χαλκού στο κύτταρο. Προηγούμενα στοιχεία έδειξαν ότι εκτός του χαλκού και πρωτεϊνικές αλληλεπιδράσεις μπορούν να τροποποιήσουν την λειτουργικότητα του Μac1(Voutsina et al, 2000). Για την ταυτοποίηση πρωτεϊνών που αλληλεπιδρούν και ρυθμίζουν την ενεργότητας του Mac1 έγιναν πειράματα σάρωσης γενωμικής βιβλιοθήκης με την τεχνολογία των δύο υβριδίων (Α. Βουτσινά, αδημοσίευτα αποτελέσματα). Μεταξύ των αλληλεπιδρώντων βρέθηκε και η πυρηνική φωσφοπρωτεΐνη Rad9. Η συγκεκριμένη πρωτεΐνη ανήκει στην κατηγορία των γονιδίων ελέγχου του κυτταρικού κύκλου και παίζει σημαντικό ρόλο στην μεταβίβαση σήματος για επιδιόρθωση DNA όταν αυτό υποστεί βλάβη από ακτινοβόληση. Σκοπός της συγκεκριμένης εργασίας είναι να επιβεβαιωθεί η αλληλεπίδραση της Rad9 με τον Mac1 και επίσης να διερευνηθούν οι φυσιολογικές συνθήκες στις οποίες συμβαίνει αυτό. Προκειμένου να επιτευχθεί αυτό ακολουθήθηκαν οι πιο κάτω προσεγγίσεις. Πραγματοποιήθηκαν πειράματα in vivo συνανοσοκατακρύμνισης των δυο πρωτεϊνών τα οποία επιβεβαίωσαν την αλληλεπίδραση των πρωτεϊνών, σε εκχυλίσματα καλλιεργειών που αναπτύχθηκαν σε συνθήκες SC ή έλλειψης χαλκού και παράλληλα κατασκευάστηκαν κατάλληλα εργαλεία (πλασμιδιακές κατασκευές) για ετερόλογη έκφραση σε βακτήρια και για περαιτέρω διερεύνηση της in vitro αλληλεπίδρασης των δυο πρωτεϊνών και υποπεριοχών τους. Επίσης πραγματοποιήθηκαν πειράματα μέτρησης της έκφρασης του CTR1 γονιδίου απουσία του γονίδιου RAD9 σε συνθήκες περίσσειας και απουσίας χαλκού όπου και φάνηκε ότι η έκφραση του συγκεκριμένου γονιδίου επάγεται σε συνθήκες SC προσδίδοντας στην Rad9 ρόλο άμεσου ή έμμεσου καταστολέα. Τέλος σε πειράματα μέτρησης της μεταγραφικής ενεργότητας του LexAMac1, φάνηκε οτι ενεργοποιείται λιγότερο σε rad9Δ στελέχη συγκριτικά με στελέχη άγριου τύπου, σε συνθήκες χαμηλής συγκέντρωσης χαλκού. Τα αποτελέσματα αυτά αν και φαινομενικά αντικρουόμενα κάνουν ενδιαφέρουσα την περαιτέρω διερεύνηση της φυσιολογικής σημασίας της αλληλεπίδρασης αυτής αλλά και των συνθηκών στις οποίες συμβαίνει.
|
Λειτουργική συσχέτιση της πρωτεΐνης Rad9 με τον χαλκορυθμιζόμενο μεταγραφικό παράγοντα Mac1 στον Saccharomyces cerevisiae
